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[摘要] 目的 总黄酮为理气舒心片的功效成分，建立总黄酮的测定方法，控制理气舒心片质量。 方法 采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，通过回流法提取，NaNO3-Al（NO3）3法显色测定样品吸光度，以芦丁为标准溶液计算求得总黄酮含量。 结果 芦丁在8.3014～33.5092mg/L浓度范围内线性关系良好，r=0.9997，平均回收率为96.14%，RSD为0.7%。 结论 三批理气舒心片样品总黄酮含量在5.20～5.87mg/片之间，该方法简便快捷，结果准确，重现性好，适用于理气舒心片中总黄酮的测定。
[关键词] 理气舒心片；功效成分；芦丁；紫外-可见分光光度法
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）07-35-04
Effect of composition control Qi Shuxin tablets quality
SHI Lei FAN Chunling CHEN Shangkun
Songyuan Institute for food and drug control，Songyuan 138000，China
[Abstract] Objective The total flavone is effective components of Qi Shuxin tablets.To establish the determination of total flavonoids，and to control Qi Shuxin tablets quality. Methods UV Vis Spectrophotometry was used to determine total flavonoids content.Extraction by refluxing method，NaNO3-Al（NO3）3 was used to color determine sample absorbance.Rutin was as the standard solution to calculate the total flavonoids content. Results Rutin had good linear relationship within the range from 8.3014 to 33.5092mg/L，r=0.9997.The average recovery was 96.14%，RSD was 0.7%. Conclusion Total flavonoids content of the three batch of Qi Shuxin tablets samples is Between 5.20-5.87mg/tablet.The method is simple，rapid，accurate and reproducible.It is suitable for determination of total flavonoids of Qi in Shuxin tablets.
[Key words] Qi Shuxin tablets；Efficacy component；Rutin；UV Vis Spectrophotometry
功效成分是指與中成药的功效直接相关的活性成分或活性成分群，是中成药疗效的基础。目前大部分的中成药标准是以指标成分控制药品中某味药材质量，比如用甘草酸的含量评价含甘草的中药复方制剂的质量，这种方法不能完全体现中成药的药用价值和自然属性。理气舒心片的处方由当归、沉香、茯苓等18味组成，具有解肝郁，行气滞，祛胸痹的功效，主要用于气滞血瘀症冠心病，心绞痛，心律不齐，气短腹胀，胸闷心悸。因处方中大多药味具有共性成分，无法以单一指标成分控制处方中药材质量。文献报道总黄酮具有增加心肌营养血流量，降低心肌耗氧量，提高动物耐缺氧能力，降低血清胆固醇，抑制血小板聚集等作用，符合理气舒心片的功能主治，可以认为总黄酮为理气舒心片的功效成分[1-5]。理气舒心片原收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册，标准中仅有一项蒲黄的显微鉴别，无法准确控制药品质量[6]。总黄酮的含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法和毛细管电泳法等，高效液相色谱法和毛细管电泳法灵敏度高，准确性好，但在测定时需要较多的黄酮化合物对照品，相对成本较高。薄层色谱扫描法和超临界流体色谱法灵敏度低，重现性差，也需要较多的黄酮化合物对照品。紫外-可见分光光度法为最常用的总黄酮测定方法之一，具有仪器廉价、操作简单、检测成本低、不需要总黄酮中各黄酮化合物对照品等优点。为确保用药安全有效，本次试验以芦丁为对照，采用紫外-可见分光光度法测定该处方中总黄酮含量，以功效成分控制药品质量。
1 仪器与试药
T9双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、UV Win V6.0.0工作站；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（中国甄城华鲁电热电器有限公司山东）；薄层加热板（瑞士卡玛）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；XS105电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号100080-201610，供UV法测定，含量为92.6%）；甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为
图1 检测波长确定紫外光谱图
分析纯，购于北京化工厂；重蒸水（自制）。理气舒心片生产企业A，批号160302；生产企业B，批号150701；生产企业C，批号57151206。
2 功效成分测定[7-15] 2.1 对照品溶液的制备
精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL中含无水芦丁0.2mg）。
2.2 标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置25mL量瓶中，各加入甲醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，再分别加入1%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，分别精密加入4%氢氧化钠溶液10mL，用水稀释至刻度，摇匀，放置15min，即得标准曲线系列溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加75%乙醇100mL，称定重量，85℃加热回流1h，放冷，用75%乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取2.5mL，置25mL量瓶中，加75%乙醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，再分别加入1%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，分别精密加入4%氢氧化钠溶液10mL，用水稀释至刻度，摇匀，放置15min，作为供试品溶液。
2.4 测定波长的选择
取芦丁对照品，加甲醇溶液适量，制成对照溶液，于紫外-可见分光光度计200～600nm范围内进行波长扫描。结果显示芦丁对照品在510nm波长处有最大吸收，故确定510nm为测定波长，见图1。
2.5 测定法
取标准曲线系列溶液，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401），在510nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。取供试品溶液，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度。
2.6 精密度考察
取同一供试品溶液，重复测定6次，所得浓度分别为16.4078、16.3834、16.3834、16.3182、16.3182、16.3671mg/L，RSD为0.3%，表明仪器的精密度良好。
2.7 稳定性考察
取精密度项下供试品溶液，30min内每5min测定一次，结果为17.9638、18.0778、17.8416、17.7194、17.5972、17.4994mg/L。RSD为1.3%，表明供试品溶液在30min内基本稳定。
2.8 重现性考察
取同一批号供试品适量，精密称取6份，依法制成供试品溶液，照上述方法分别测定浓度，计算每片含量，所得结果分别为5.30、5.41、5.35、5.44、5.48、5.42mg/片。RSD为1.2%，表明方法重现性良好。
2.9 线性考察
取标准曲线系列溶液测定，结果在测定浓度8.3014～33.5092mg/L范围内，吸光度与浓度呈良好的线性关系。y=0.01228x+0.00159，r=0.9997。
2.10 回收率考察
取已知含量的供試品6份，除去包衣，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，精密加入芦丁对照品8mg，照供试品溶液制备方法制成回收率测定溶液，在510nm波长处测定吸光度，计算回收率，结果表明本方法回收率结果符合方法学要求，见表1。
2.11 样品的测定
以供试品溶液的制备方法制备3批理气舒心片供试品溶液，依照上述方法测定含量，所得结果见表2。
3 讨论
根据芦丁的物理性质，1g芦丁可溶于7mL甲醇、23mL沸乙醇、290mL冷乙醇，说明芦丁在甲醇中的溶解性较高，所以选择甲醇为对照品的溶解溶剂。样品提取溶剂选择不同浓度乙醇试验，乙醇浓度越大，极性越小，增大极性小的黄酮类溶出，从而在一定乙醇浓度范围内，提取含量呈上升趋势；当乙醇浓度超过一定范围，即极性过大，减少了黄酮糖苷类的溶出，从而提取含量呈下降趋势，经试验所得结论为，乙醇浓度的最优水平为75%。对提取温度进行考察，当温度低于85℃时，随着温度的升高，热动力学增加了黄酮类的溶出，从而提取含量呈上升趋势，当温度高于85℃时，可能黄酮发生了水解或裂解，提取含量呈下降趋势，所以提取温度选择为85℃。对提取时间进行考察，试验了回流30、45、60和75min，所得含量表明加热回流60min时含量最高，高于60min含量结果提取不明显，确定加热回流时间为60min。提取溶剂量的选择，试验了加入量50、75、100和125mL，实验结果显示100mL时样品提取完全，增加溶剂量试验，含量测定结果不在增加，所以选择100mL为提取溶剂用量。
总黄酮具有保护造血系统、保护免疫系统、清除自由基、抗氧化、保护DNA等作用，黄酮类化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物，一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构，黄酮类化合物以其广谱的药理作用备受青睐。本研究根据黄酮类化合物的3-羟基、4-羟基或5-羟基、4-羟基或邻二位酚羟基与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的特点建立，用分光光度法在510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。选用芦丁作为标准品的原因是芦丁具有典型的黄酮类结构和紫外特征，在很多含有黄酮类物质的植物中广泛存在，而且含量比较高，芦丁比较容易分离得到纯体，作为对照品比较易得。
紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量多用于中药材，中成药中比较少见。理气舒心片为治疗冠心病心绞痛常用药，因处方中药味较多，无法逐一建立含量测定方法控制各药味质量，经查阅文献资料，仅有一篇《HPLC同时测定理气舒心片中3种活性成分》报道，以柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷为对照品进行含量测定。该方法只能控制处方中青皮、陈皮、枳实等少数药味的质量，柚皮苷为二氢黄酮、橙皮苷和新橙皮苷均为二氢黄酮衍生物，都是黄酮类成分，却无法代表处方中所有黄酮类化合物，难以达到整体控制的效果。一般来说，一种中药所含的化学成分少则十几种，多则上百种，复方制剂就更加复杂，其中相互之间还有可能发生反应产生新的成分，而目前对中药成分的研究大多局限于含量较高的成分上，即指标成分，这就可能忽视了其他成分的作用或其综合作用。如麻黄碱作为麻黄的指标性成分具有明显的止咳平喘作用，但麻黄能解表散寒的作用却不能从麻黄碱的药理作用中得到证实。功效成分是与中药材和中成药的功效直接相关的活性成分或活性成分群，是中成药疗效的基础，功效成分与中成药的疗效之间存在着必然的联系，功效成分的研究对新药开发也有着重要的指导意义，应作为中成药质量控制和新药研发的研究方向。 [参考文献]
[1] 薄锋.“金钱草总黄酮”抗心肌缺血药理作用研究[D].长春：长春中医药大学，2010：1-34.
[2] 王博文，马凤良.理氣舒心片治疗冠心病心绞痛60例疗效分析[J].吉林中医药，1982（3）：22-23.
[3] 张雪梅，张树勋，崔文秀，等.理气舒心片对大鼠实验性心肌坏死的保护作用[J].吉林中医药，1984（4）：30-31.
[4] 白生文，汤超，田京，等.沙棘果渣总黄酮提取工艺及抗氧化活性分析[J].食品科学，2015，36（10）：59-64.
[5] 隋殿军，邱智东，陈雪松，等.蜂胶总黄酮滴丸治疗冠心病心绞痛临床研究[J].新中医，2011，43 （11）：8-10.
[6] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第四册[S].北京：中华人民共和国卫生部，1991：172.
[7] 国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：1483-1484.
[8] 国家食品药品监督管理局标准YBZ01882008[S]：2008.
[9] 马陶陶，张群林，李俊，等.中药总黄酮的含量测定方法[J].安徽医药，2007，11（11）：1030-1032.
[10] 张琪，刘慧灵，朱瑞，等.苦荞麦中总黄酮和芦丁的含量测定方法的研究[J].食品科学，2003，24（7）：113-116.
[11] 张静娇，李宪刚，鄢长余，等.HPLC同时测定理气舒心片中3种活性成分[J].中国医药科学，2016，6（15）：44-46.
[12] 兰才.山楂叶总黄酮含量测定[J].现代医药卫生，2013，29（9）：1382.
[13] 郑媛媛，李辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：547-550.
[14] 田春莲，蒋凤开.茜草总黄酮提取工艺研究[J].食品科学，2011，32（24）：60-63.
[15] 赵子龙，薛培凤，倪佩东，等.天然药物中总黄酮的提取工艺研究进展[N].内蒙古医学院学报，2012，34（6）：512-516.
（收稿日期：2017-01-21）
[关键词] 理气舒心片；功效成分；芦丁；紫外-可见分光光度法
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）07-35-04
Effect of composition control Qi Shuxin tablets quality
SHI Lei FAN Chunling CHEN Shangkun
Songyuan Institute for food and drug control，Songyuan 138000，China
[Abstract] Objective The total flavone is effective components of Qi Shuxin tablets.To establish the determination of total flavonoids，and to control Qi Shuxin tablets quality. Methods UV Vis Spectrophotometry was used to determine total flavonoids content.Extraction by refluxing method，NaNO3-Al（NO3）3 was used to color determine sample absorbance.Rutin was as the standard solution to calculate the total flavonoids content. Results Rutin had good linear relationship within the range from 8.3014 to 33.5092mg/L，r=0.9997.The average recovery was 96.14%，RSD was 0.7%. Conclusion Total flavonoids content of the three batch of Qi Shuxin tablets samples is Between 5.20-5.87mg/tablet.The method is simple，rapid，accurate and reproducible.It is suitable for determination of total flavonoids of Qi in Shuxin tablets.
[Key words] Qi Shuxin tablets；Efficacy component；Rutin；UV Vis Spectrophotometry
功效成分是指與中成药的功效直接相关的活性成分或活性成分群，是中成药疗效的基础。目前大部分的中成药标准是以指标成分控制药品中某味药材质量，比如用甘草酸的含量评价含甘草的中药复方制剂的质量，这种方法不能完全体现中成药的药用价值和自然属性。理气舒心片的处方由当归、沉香、茯苓等18味组成，具有解肝郁，行气滞，祛胸痹的功效，主要用于气滞血瘀症冠心病，心绞痛，心律不齐，气短腹胀，胸闷心悸。因处方中大多药味具有共性成分，无法以单一指标成分控制处方中药材质量。文献报道总黄酮具有增加心肌营养血流量，降低心肌耗氧量，提高动物耐缺氧能力，降低血清胆固醇，抑制血小板聚集等作用，符合理气舒心片的功能主治，可以认为总黄酮为理气舒心片的功效成分[1-5]。理气舒心片原收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册，标准中仅有一项蒲黄的显微鉴别，无法准确控制药品质量[6]。总黄酮的含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法和毛细管电泳法等，高效液相色谱法和毛细管电泳法灵敏度高，准确性好，但在测定时需要较多的黄酮化合物对照品，相对成本较高。薄层色谱扫描法和超临界流体色谱法灵敏度低，重现性差，也需要较多的黄酮化合物对照品。紫外-可见分光光度法为最常用的总黄酮测定方法之一，具有仪器廉价、操作简单、检测成本低、不需要总黄酮中各黄酮化合物对照品等优点。为确保用药安全有效，本次试验以芦丁为对照，采用紫外-可见分光光度法测定该处方中总黄酮含量，以功效成分控制药品质量。
1 仪器与试药
T9双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、UV Win V6.0.0工作站；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（中国甄城华鲁电热电器有限公司山东）；薄层加热板（瑞士卡玛）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；XS105电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号100080-201610，供UV法测定，含量为92.6%）；甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为
图1 检测波长确定紫外光谱图
分析纯，购于北京化工厂；重蒸水（自制）。理气舒心片生产企业A，批号160302；生产企业B，批号150701；生产企业C，批号57151206。
2 功效成分测定[7-15] 2.1 对照品溶液的制备
精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL中含无水芦丁0.2mg）。
2.2 标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置25mL量瓶中，各加入甲醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，再分别加入1%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，分别精密加入4%氢氧化钠溶液10mL，用水稀释至刻度，摇匀，放置15min，即得标准曲线系列溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加75%乙醇100mL，称定重量，85℃加热回流1h，放冷，用75%乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取2.5mL，置25mL量瓶中，加75%乙醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，再分别加入1%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，分别精密加入4%氢氧化钠溶液10mL，用水稀释至刻度，摇匀，放置15min，作为供试品溶液。
2.4 测定波长的选择
取芦丁对照品，加甲醇溶液适量，制成对照溶液，于紫外-可见分光光度计200～600nm范围内进行波长扫描。结果显示芦丁对照品在510nm波长处有最大吸收，故确定510nm为测定波长，见图1。
2.5 测定法
取标准曲线系列溶液，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401），在510nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。取供试品溶液，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度。
2.6 精密度考察
取同一供试品溶液，重复测定6次，所得浓度分别为16.4078、16.3834、16.3834、16.3182、16.3182、16.3671mg/L，RSD为0.3%，表明仪器的精密度良好。
2.7 稳定性考察
取精密度项下供试品溶液，30min内每5min测定一次，结果为17.9638、18.0778、17.8416、17.7194、17.5972、17.4994mg/L。RSD为1.3%，表明供试品溶液在30min内基本稳定。
2.8 重现性考察
取同一批号供试品适量，精密称取6份，依法制成供试品溶液，照上述方法分别测定浓度，计算每片含量，所得结果分别为5.30、5.41、5.35、5.44、5.48、5.42mg/片。RSD为1.2%，表明方法重现性良好。
2.9 线性考察
取标准曲线系列溶液测定，结果在测定浓度8.3014～33.5092mg/L范围内，吸光度与浓度呈良好的线性关系。y=0.01228x+0.00159，r=0.9997。
2.10 回收率考察
取已知含量的供試品6份，除去包衣，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，精密加入芦丁对照品8mg，照供试品溶液制备方法制成回收率测定溶液，在510nm波长处测定吸光度，计算回收率，结果表明本方法回收率结果符合方法学要求，见表1。
2.11 样品的测定
以供试品溶液的制备方法制备3批理气舒心片供试品溶液，依照上述方法测定含量，所得结果见表2。
3 讨论
根据芦丁的物理性质，1g芦丁可溶于7mL甲醇、23mL沸乙醇、290mL冷乙醇，说明芦丁在甲醇中的溶解性较高，所以选择甲醇为对照品的溶解溶剂。样品提取溶剂选择不同浓度乙醇试验，乙醇浓度越大，极性越小，增大极性小的黄酮类溶出，从而在一定乙醇浓度范围内，提取含量呈上升趋势；当乙醇浓度超过一定范围，即极性过大，减少了黄酮糖苷类的溶出，从而提取含量呈下降趋势，经试验所得结论为，乙醇浓度的最优水平为75%。对提取温度进行考察，当温度低于85℃时，随着温度的升高，热动力学增加了黄酮类的溶出，从而提取含量呈上升趋势，当温度高于85℃时，可能黄酮发生了水解或裂解，提取含量呈下降趋势，所以提取温度选择为85℃。对提取时间进行考察，试验了回流30、45、60和75min，所得含量表明加热回流60min时含量最高，高于60min含量结果提取不明显，确定加热回流时间为60min。提取溶剂量的选择，试验了加入量50、75、100和125mL，实验结果显示100mL时样品提取完全，增加溶剂量试验，含量测定结果不在增加，所以选择100mL为提取溶剂用量。
总黄酮具有保护造血系统、保护免疫系统、清除自由基、抗氧化、保护DNA等作用，黄酮类化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物，一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构，黄酮类化合物以其广谱的药理作用备受青睐。本研究根据黄酮类化合物的3-羟基、4-羟基或5-羟基、4-羟基或邻二位酚羟基与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的特点建立，用分光光度法在510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。选用芦丁作为标准品的原因是芦丁具有典型的黄酮类结构和紫外特征，在很多含有黄酮类物质的植物中广泛存在，而且含量比较高，芦丁比较容易分离得到纯体，作为对照品比较易得。
紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量多用于中药材，中成药中比较少见。理气舒心片为治疗冠心病心绞痛常用药，因处方中药味较多，无法逐一建立含量测定方法控制各药味质量，经查阅文献资料，仅有一篇《HPLC同时测定理气舒心片中3种活性成分》报道，以柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷为对照品进行含量测定。该方法只能控制处方中青皮、陈皮、枳实等少数药味的质量，柚皮苷为二氢黄酮、橙皮苷和新橙皮苷均为二氢黄酮衍生物，都是黄酮类成分，却无法代表处方中所有黄酮类化合物，难以达到整体控制的效果。一般来说，一种中药所含的化学成分少则十几种，多则上百种，复方制剂就更加复杂，其中相互之间还有可能发生反应产生新的成分，而目前对中药成分的研究大多局限于含量较高的成分上，即指标成分，这就可能忽视了其他成分的作用或其综合作用。如麻黄碱作为麻黄的指标性成分具有明显的止咳平喘作用，但麻黄能解表散寒的作用却不能从麻黄碱的药理作用中得到证实。功效成分是与中药材和中成药的功效直接相关的活性成分或活性成分群，是中成药疗效的基础，功效成分与中成药的疗效之间存在着必然的联系，功效成分的研究对新药开发也有着重要的指导意义，应作为中成药质量控制和新药研发的研究方向。 [参考文献]
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（收稿日期：2017-01-21）