【摘 要】
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目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建血小板衍生生长因子(PDGF)-BB刺激的大鼠HSC上调基因的cDNA消减文库,从分子生物学角度阐明PDGF在肝纤维化中的作用机制.方法 以PDGF-BB
【机 构】
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哈尔滨医科大学附属第四医院感染科,北京地坛医院传染病研究所,哈尔滨医科大学附属第一医院感染科
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目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建血小板衍生生长因子(PDGF)-BB刺激的大鼠HSC上调基因的cDNA消减文库,从分子生物学角度阐明PDGF在肝纤维化中的作用机制.方法 以PDGF-BB刺激的HSC作为实验组,以未用PDGF-BB刺激的HSC作为对照组,分别收获细胞提取总mRNA,并逆转录为cDNA.经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增.将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析.结果 成功构建了PDGF-BB刺激HSC差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到102个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到93个200～1000 bp的插入片段.挑取含有插入片段的31个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得13种已知基因序列,主要包括电压依赖性阴离子通道、热休克蛋白质47、Ras家族基因RAN等蛋白质基因.结论 PDGF-BB作为最有效的促有丝分裂原在激活HSC过程中上调某些与细胞生长相关的蛋白质、参与细胞内代谢的蛋白质及分子伴侣蛋白质等基因的表达,这将为进一步阐明PDGF-BB刺激HSC介导肝纤维化的分子生物学机制提供理论依据.
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