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摘 要 采用形态特征鉴定及rDNA-ITS序列分析相结合的方法，对海南可可黑果病病原进行鉴定，并通过定点连续调查研究该病在海南的发生规律。结果表明，该病病原为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。降雨量对该病的发生有着显著的影响，在海南发病高峰期一般在9～11月份。
关键词 可可黑果病；病原鉴定；核糖体DNA-ITS；发病规律
中图分类号 S432.44 文献标识码A
Pathogen Identification and Occurrence of Cacao
Black Pod in Hainan Province
SANG Liwei1，2， LIU Aiqin1，2 *， SUN Shiwei1，2， GAO Shengfeng1，2
GOU Yafeng1，2， TAN Lehe1，2
1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and
Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China
Abstract Cacao Black pod is an important disease threatening cocoa industry， The pathogen and occurrence of cacao black pod were studied through the morphological characteristics and the sequence of ribosomal DNA-ITS.Results showed that the pathogen from Hainan was Phytophthora citrophthora and the weather condition had obvious effects on the occurrence of the disease， especially for rainfall. The period of peak incidence in Hainan is September - November.
Key words Cacao Black pod； Pathogen identification； Ribosomal DNA-ITS； Occurrence
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.023
可可（Theobroma cacao L.）是世界三大饮料作物之一，产量仅次于咖啡和茶叶。可可果实营养丰富，味醇香，具有兴奋与滋补作用，可可豆加工成可可脂和可可粉，可可脂主要用于制作巧克力，可可粉用来配制高级饮料。现在世界主要产地为委内瑞拉、巴西、加纳等热带地区。中国1922年引入台湾，1954年引入海南岛试种[1]。1960年中国热带农业科学院香料饮料研究所（原兴隆试验站，以下简称“香饮所”）引种试种，对可可的生物学特性及适应性进行了长期系统的观察研究，证实可可适合在海南省东南部发展[2]。目前，海南省可可种植面积为70多hm2，主要分布在万宁和陵水。目前我国所需可可豆主要靠进口，种植可可市场前景广阔。
可可黑果病（又称可可疫病）是为害可可最严重的一种真菌病害，主要危害可可果实，引起黑色腐烂，产量损失可达50%[3]。2010年10月，在香饮所可可种植园首次发现该病，主要为害嫩果，为害率达15%左右。此后有扩大蔓延之势，对可可产业的推广发展造成很大威胁。准确地鉴定引起该病的病原菌并摸清其发生规律是制定防控策略的基础。国外报道可可黑果病的病原主要有Phytophthora palmivora、P. citrophthora、P. megakarya、P. capsici等[4]，其中，Phytophthora palmivora是世界性分布，P. citrophthora和P. capsici主要为害巴西、印度、墨西哥等的可可果，P. megakarya则在喀麦隆、加蓬、加纳、尼日利亚等的受害可可果中被发现。关于海南省可可黑果病的病原及其发生规律还未见报道。本研究采用形态学特征鉴定和核糖体DNA-ITS 序列分析相结合，对海南可可黑果病病原进行鉴定；通过定点定期观察，摸清该病发生流行与气候条件之间的关系，以期为进一步开展可可黑果病防治技术研究提供科学依据，为海南可可产业的快速发展提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 从香饮所可可种植基地发生可可黑果病的果实中分离获得致病菌株“kk6a”，保存于香饮所病虫害防控研究室。
1.1.2 试验试剂 PDA培养基：称取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再加葡萄糖16 g和琼脂15 g，继续加热搅拌混匀，稍冷却后加去离子水至1 000 mL，（121 ℃）灭菌20 min左右后取出备用。
快速DNA提取检测试剂盒（KG203）：由天根生化科技（北京）有限公司生产。
1.1.3 试验仪器 专业显微数码摄像系统、PCR仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机等。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离及其致病性测定 从香饮所可可种植基地采集发病的可可果样品带回实验室进行分离，同时记录田间为害症状，分离及致病性测定方法参见文献[5]。 1.2.2 病原菌鉴定
（1）形态特征鉴定。方法参见文献[6]。将病原菌接种到PDA培养基平板上培养5 d后，观测菌落、菌丝的形态特征；从菌落边缘切取1.5 mm×1.5 mm的菌丝块，移至灭菌水中，在25 ℃光照条件下培养5 d，每隔12 h换1次灭菌水，在显微镜下观测孢子囊的形态大小等特征；将待测菌株分别与Phytophthora palmivora A1、A2标准菌株在PDA平板上进行配对培养，半个月后观察是否产生卵孢子。
（2）rDNA-ITS序列分析。基因组DNA提取、PCR反应参数以及扩增产物的克隆参照王源超[7]的方法，采用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAAC
CTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT
GC-3′，PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。利用Mega 5.0系统发育分析软件对病原菌rDNA-ITS序列构建系统发育树。
1.2.3 发生规律观察 2011～2013年，在香饮所可可种植基地随机选取5个小区[8]，每小区选10株，小区面积50 m2，共50株。每隔10 d调查1次，每月调查3次，计算每个月的平均发病率。试验小区生长季节不进行药剂防治，水肥管理及农事操作正常进行。每月平均降雨量、平均温度及相对湿度等气象资料由万宁市气象局和香饮所生态研究室提供。运用SPSS软件，分析病害发生率同降雨量、温度及相对湿度等气象因子之间的相关性。
2 结果与分析
2.1 为害症状
病菌主要侵害荚果。荚果染病（图1），开始在果面出现细小的半透明斑点，很快变褐色，后变黑色，斑点迅速扩大，直到整个荚果表面被黑色斑块覆盖。潮湿时病果表面长出一层白色霉状物，剖开病果内部组织变褐色。后期病果干缩、变黑、不脱落。
2.2 病原菌分离及其致病性测定
从采集的样品中分离获得菌株“kk6a”。按照柯赫氏法则，结果发现将菌株“kk6a”回接后可可果的表现症状与田间自然为害症状一致（图2），且从发病可可果上可以重新分离到该菌株，因此确定菌株“kk6a”是可可黑果病的致病菌。
2.3 病原菌鉴定
2.3.1 形态特征 菌株kk6a在PDA培养基上菌落生长茂盛，绒毛或绵絮状，呈白色（图3）。菌丝粗2～6 μm，平均4 μm；具少量球形菌丝膨大体，顶生，直径24～35 μm（图4～5）。孢子囊形态变异较大，卵形、椭圆形、倒梨形或不规则形，基部圆形，大小为29～91 μm×25～49 μm，平均60 μm×30.2 μm，长宽比为1.1～2.1，平均1.7；具明显乳突，大多1个，少数2个，乳突高2～6 μm；孢子囊不脱落，柄长8～20 μm。孢囊梗简单合轴分枝、不规则分枝或不分枝，粗1.5～4.0 μm（图6）。在PDA培养基上与标准菌配对培养，未见有性器官产生。
以上形态特征表明，菌株kk6a可能是柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。
2.3.2 rDNA-ITS序列分析 分析结果表明，菌株“kk6a”的rDNA-ITS基因序列长度为828 bp（GenBank登录号为KF269243）。将菌株kk6a的rDNA-ITS序列在GenBank中进行同源性比对，发现与其同源性最高的150个ITS序列菌株全部为疫霉菌，同源性达到94%～100%，其中与菌株KF269243.1、GU111603.1、GU111602.1的同源性分别为100%、99%和99%，这3个菌株均为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。结合形态学特征和核糖体DNA-ITS序列的分析，进一步利用Mega 5.0系统发育分析软件建立菌株kk6a的系统发育树，结果是菌株kk6a的序列与GenBank中Phytophthora citrophthora（登录号：KF269243.1）的遗传距离最近，位于系统发育树的同一分支（图7）。进一步证明了本研究从香饮所可可种植基地受害果中分离的致病菌kk6a为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。
2.4 病害发生规律
由图8～10可见海南可可黑果病的发生规律。SPSS相关性分析结果表明，2011年该病发生率与降雨量、相对湿度及气温的相关系数（r）分别为0.76、0.74和0.32（p=0.01），2012年相关系数（r）分别为0.77、0.43、0.21，2013年相关系数（r）分别为0.95、0.61和0.19。可见，发病率与降雨量之间具有很强的相关性（r=0.76～0.95），降雨量越多，发病率越高；发病率与相对湿度之间的相关性中等（r=0.43～0.74）；发病率与气温之间呈弱相关（r=0.19～0.32）。
降雨量是影响可可黑果病发生和流行的最主要因素。在海南，此病菌在旱季进入休眠状态，病菌在表层土壤、残留在树上的病果或其他寄主植物中存活，2～3月份连续一段阴雨天后，从这些处所产生孢子囊，孢子囊主要借雨水溅散传播，为流行提供初侵染菌源，可可植株开始出现零星病果，发病率一般在5%左右；直到5月份出现雨水较多之前发病率一般不超过15%；6～8月份气温高雨水较少，出现短暂干旱，病害停止发展，发病率降低；到9～11月份台风雨季，连续强降雨后发病率急剧上升，严重时发病率达40%以上；12月至翌年1月出现低温少雨干旱天气病害流行结束。2012年10月底至11月中旬，可可树同时出现开花、结小果、成熟果的物候期，且兴隆地区连续出现降雨天气，气温均在20～30 ℃之间，所以这段时间可可疫病相对严重，发病率40%左右。总之，在持续高湿的地区黑果病特别严重，小果期连续降雨且出现20～27 ℃的气温是该病发生的主要条件。 3 讨论与结论
可可黑果病可由多种病原菌引起，Blaha G[4]利用同工酶技术和RFLP方法鉴定发现Phytophthora palmivora（sensu stricto）、P. megakarya、P. capsici和P. citrophthora等均可引起可可黑果病。徐同等[9]从喀麦隆主要可可产区自然发病的黑果病病果中分离到12个疫霉菌株，并对这些疫霉菌株的形态学、生理特征及致病性进行了鉴定，结果这12个疫霉菌株均为P. megakarya。本研究采用形态特征鉴定及rDNA-ITS序列分析相结合的方法，将海南可可黑果病病原鉴定为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。由于本研究调查范围和取样数量有限，是否也有其他几种国外报道的疫霉菌引起该病还有待进一步研究。
Deberdt P等[10]研究指出由P. megakarya引起的可可黑果病的发病率与降雨量之间呈显著正相关，但未明确气温和湿度与该病发病率之间的相关性大小。本文研究结果表明，在海南，可可黑果病发病率与降雨量之间具有很强的相关性（r=0.76～0.95），降雨量越多，发病率越高；发病率与相对湿度之间的相关性为中等（r=0.43～0.74）；发病率与气温之间呈弱相关（r=0.19～0.32）。在海南，可可几乎周年都可开花，但以每年5～11月开花最多（占全年的94%左右），从开花到结成幼果将近2个月时间，因此7～11月正是幼果期集中的时期，而8～11月恰逢高温多雨和台风雨季节，因此可可黑果病的发病高峰期与幼果期相对一致，这也说明该病菌主要侵染幼果。在生产上建议在每年8月中下旬雨季来临前，全园进行可可黑果病预防，否则严重时可导致40%以上的可可幼果腐烂脱落，严重影响产量。
本次将菌株kk6a在PDA平板上进行单株培养及与Phytophthora palmivora A1、A2标准菌株进行配对培养，都未发现有性器官产生，可能是本研究所获得的菌株丧失了育性或育性较弱。ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，已有的研究结果表明，ITS在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息。本研究采用分子生物学方法对海南可可黑果病致病菌kk6a的核糖体DNA-ITS序列进行分析，其核糖体DNA-ITS序列与柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）的同源性为100%，从分子生物学水平上进一步鉴定菌株kk6a为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。
参考文献
[1] 华南亚热带作物科学研究所华南热带作物学院. 热带作物栽培学[M]. 北京： 农业出版社， 1962.
[2] 朱自慧. 世界可可业概况与发展海南可可业的建议[J]. 热带农业科学， 2003， 23（3）： 28-33.
[3] Deberdt P， Mfegue C V， Tondje P R， et al. Impact of environmental factors， chemical fungicide and biological control on cacao pod production dynamics and black pod disease（Phytophthora megakarya）in Cameroon[J]. Biological Control： Theory and Application in Pest Management， 2008， 44（2）：149-159.
[4] Blaha G. Use of isoenzyme patterns and RFLP to identify the Phytophthora spp. on cacao[J]. Bulletin OEPP， 1990， 20（1）：59-65.
[5] 方中达. 植病研究方法[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[6] 郑小波. 疫霉菌及其研究技术[M]. 北京：中国农业出版社， 1997.
[7] 王源超， 张正光， 郑小波. 核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、 恶疫霉分类辅助性状的研究[J]. 菌物系统， 2000， 19（4）： 485-491.
[8] 刘爱勤， 曾 涛， 曾会才， 等. 海南香草兰疫病发生情况调查及疫霉菌种类鉴定[J]. 热带作物学报， 2008（6）： 803-807.
[9] 徐 同， Fouda Bikoe J C， Omokolo D N， et al. 喀麦隆可可黑果病病原疫霉种的鉴定[J]. 菌物系统， 1998， 17（2）： 190-192.
责任编辑：沈德发
关键词 可可黑果病；病原鉴定；核糖体DNA-ITS；发病规律
中图分类号 S432.44 文献标识码A
Pathogen Identification and Occurrence of Cacao
Black Pod in Hainan Province
SANG Liwei1，2， LIU Aiqin1，2 *， SUN Shiwei1，2， GAO Shengfeng1，2
GOU Yafeng1，2， TAN Lehe1，2
1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and
Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China
Abstract Cacao Black pod is an important disease threatening cocoa industry， The pathogen and occurrence of cacao black pod were studied through the morphological characteristics and the sequence of ribosomal DNA-ITS.Results showed that the pathogen from Hainan was Phytophthora citrophthora and the weather condition had obvious effects on the occurrence of the disease， especially for rainfall. The period of peak incidence in Hainan is September - November.
Key words Cacao Black pod； Pathogen identification； Ribosomal DNA-ITS； Occurrence
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.023
可可（Theobroma cacao L.）是世界三大饮料作物之一，产量仅次于咖啡和茶叶。可可果实营养丰富，味醇香，具有兴奋与滋补作用，可可豆加工成可可脂和可可粉，可可脂主要用于制作巧克力，可可粉用来配制高级饮料。现在世界主要产地为委内瑞拉、巴西、加纳等热带地区。中国1922年引入台湾，1954年引入海南岛试种[1]。1960年中国热带农业科学院香料饮料研究所（原兴隆试验站，以下简称“香饮所”）引种试种，对可可的生物学特性及适应性进行了长期系统的观察研究，证实可可适合在海南省东南部发展[2]。目前，海南省可可种植面积为70多hm2，主要分布在万宁和陵水。目前我国所需可可豆主要靠进口，种植可可市场前景广阔。
可可黑果病（又称可可疫病）是为害可可最严重的一种真菌病害，主要危害可可果实，引起黑色腐烂，产量损失可达50%[3]。2010年10月，在香饮所可可种植园首次发现该病，主要为害嫩果，为害率达15%左右。此后有扩大蔓延之势，对可可产业的推广发展造成很大威胁。准确地鉴定引起该病的病原菌并摸清其发生规律是制定防控策略的基础。国外报道可可黑果病的病原主要有Phytophthora palmivora、P. citrophthora、P. megakarya、P. capsici等[4]，其中，Phytophthora palmivora是世界性分布，P. citrophthora和P. capsici主要为害巴西、印度、墨西哥等的可可果，P. megakarya则在喀麦隆、加蓬、加纳、尼日利亚等的受害可可果中被发现。关于海南省可可黑果病的病原及其发生规律还未见报道。本研究采用形态学特征鉴定和核糖体DNA-ITS 序列分析相结合，对海南可可黑果病病原进行鉴定；通过定点定期观察，摸清该病发生流行与气候条件之间的关系，以期为进一步开展可可黑果病防治技术研究提供科学依据，为海南可可产业的快速发展提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 从香饮所可可种植基地发生可可黑果病的果实中分离获得致病菌株“kk6a”，保存于香饮所病虫害防控研究室。
1.1.2 试验试剂 PDA培养基：称取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再加葡萄糖16 g和琼脂15 g，继续加热搅拌混匀，稍冷却后加去离子水至1 000 mL，（121 ℃）灭菌20 min左右后取出备用。
快速DNA提取检测试剂盒（KG203）：由天根生化科技（北京）有限公司生产。
1.1.3 试验仪器 专业显微数码摄像系统、PCR仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机等。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离及其致病性测定 从香饮所可可种植基地采集发病的可可果样品带回实验室进行分离，同时记录田间为害症状，分离及致病性测定方法参见文献[5]。 1.2.2 病原菌鉴定
（1）形态特征鉴定。方法参见文献[6]。将病原菌接种到PDA培养基平板上培养5 d后，观测菌落、菌丝的形态特征；从菌落边缘切取1.5 mm×1.5 mm的菌丝块，移至灭菌水中，在25 ℃光照条件下培养5 d，每隔12 h换1次灭菌水，在显微镜下观测孢子囊的形态大小等特征；将待测菌株分别与Phytophthora palmivora A1、A2标准菌株在PDA平板上进行配对培养，半个月后观察是否产生卵孢子。
（2）rDNA-ITS序列分析。基因组DNA提取、PCR反应参数以及扩增产物的克隆参照王源超[7]的方法，采用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAAC
CTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT
GC-3′，PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。利用Mega 5.0系统发育分析软件对病原菌rDNA-ITS序列构建系统发育树。
1.2.3 发生规律观察 2011～2013年，在香饮所可可种植基地随机选取5个小区[8]，每小区选10株，小区面积50 m2，共50株。每隔10 d调查1次，每月调查3次，计算每个月的平均发病率。试验小区生长季节不进行药剂防治，水肥管理及农事操作正常进行。每月平均降雨量、平均温度及相对湿度等气象资料由万宁市气象局和香饮所生态研究室提供。运用SPSS软件，分析病害发生率同降雨量、温度及相对湿度等气象因子之间的相关性。
2 结果与分析
2.1 为害症状
病菌主要侵害荚果。荚果染病（图1），开始在果面出现细小的半透明斑点，很快变褐色，后变黑色，斑点迅速扩大，直到整个荚果表面被黑色斑块覆盖。潮湿时病果表面长出一层白色霉状物，剖开病果内部组织变褐色。后期病果干缩、变黑、不脱落。
2.2 病原菌分离及其致病性测定
从采集的样品中分离获得菌株“kk6a”。按照柯赫氏法则，结果发现将菌株“kk6a”回接后可可果的表现症状与田间自然为害症状一致（图2），且从发病可可果上可以重新分离到该菌株，因此确定菌株“kk6a”是可可黑果病的致病菌。
2.3 病原菌鉴定
2.3.1 形态特征 菌株kk6a在PDA培养基上菌落生长茂盛，绒毛或绵絮状，呈白色（图3）。菌丝粗2～6 μm，平均4 μm；具少量球形菌丝膨大体，顶生，直径24～35 μm（图4～5）。孢子囊形态变异较大，卵形、椭圆形、倒梨形或不规则形，基部圆形，大小为29～91 μm×25～49 μm，平均60 μm×30.2 μm，长宽比为1.1～2.1，平均1.7；具明显乳突，大多1个，少数2个，乳突高2～6 μm；孢子囊不脱落，柄长8～20 μm。孢囊梗简单合轴分枝、不规则分枝或不分枝，粗1.5～4.0 μm（图6）。在PDA培养基上与标准菌配对培养，未见有性器官产生。
以上形态特征表明，菌株kk6a可能是柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。
2.3.2 rDNA-ITS序列分析 分析结果表明，菌株“kk6a”的rDNA-ITS基因序列长度为828 bp（GenBank登录号为KF269243）。将菌株kk6a的rDNA-ITS序列在GenBank中进行同源性比对，发现与其同源性最高的150个ITS序列菌株全部为疫霉菌，同源性达到94%～100%，其中与菌株KF269243.1、GU111603.1、GU111602.1的同源性分别为100%、99%和99%，这3个菌株均为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。结合形态学特征和核糖体DNA-ITS序列的分析，进一步利用Mega 5.0系统发育分析软件建立菌株kk6a的系统发育树，结果是菌株kk6a的序列与GenBank中Phytophthora citrophthora（登录号：KF269243.1）的遗传距离最近，位于系统发育树的同一分支（图7）。进一步证明了本研究从香饮所可可种植基地受害果中分离的致病菌kk6a为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。
2.4 病害发生规律
由图8～10可见海南可可黑果病的发生规律。SPSS相关性分析结果表明，2011年该病发生率与降雨量、相对湿度及气温的相关系数（r）分别为0.76、0.74和0.32（p=0.01），2012年相关系数（r）分别为0.77、0.43、0.21，2013年相关系数（r）分别为0.95、0.61和0.19。可见，发病率与降雨量之间具有很强的相关性（r=0.76～0.95），降雨量越多，发病率越高；发病率与相对湿度之间的相关性中等（r=0.43～0.74）；发病率与气温之间呈弱相关（r=0.19～0.32）。
降雨量是影响可可黑果病发生和流行的最主要因素。在海南，此病菌在旱季进入休眠状态，病菌在表层土壤、残留在树上的病果或其他寄主植物中存活，2～3月份连续一段阴雨天后，从这些处所产生孢子囊，孢子囊主要借雨水溅散传播，为流行提供初侵染菌源，可可植株开始出现零星病果，发病率一般在5%左右；直到5月份出现雨水较多之前发病率一般不超过15%；6～8月份气温高雨水较少，出现短暂干旱，病害停止发展，发病率降低；到9～11月份台风雨季，连续强降雨后发病率急剧上升，严重时发病率达40%以上；12月至翌年1月出现低温少雨干旱天气病害流行结束。2012年10月底至11月中旬，可可树同时出现开花、结小果、成熟果的物候期，且兴隆地区连续出现降雨天气，气温均在20～30 ℃之间，所以这段时间可可疫病相对严重，发病率40%左右。总之，在持续高湿的地区黑果病特别严重，小果期连续降雨且出现20～27 ℃的气温是该病发生的主要条件。 3 讨论与结论
可可黑果病可由多种病原菌引起，Blaha G[4]利用同工酶技术和RFLP方法鉴定发现Phytophthora palmivora（sensu stricto）、P. megakarya、P. capsici和P. citrophthora等均可引起可可黑果病。徐同等[9]从喀麦隆主要可可产区自然发病的黑果病病果中分离到12个疫霉菌株，并对这些疫霉菌株的形态学、生理特征及致病性进行了鉴定，结果这12个疫霉菌株均为P. megakarya。本研究采用形态特征鉴定及rDNA-ITS序列分析相结合的方法，将海南可可黑果病病原鉴定为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。由于本研究调查范围和取样数量有限，是否也有其他几种国外报道的疫霉菌引起该病还有待进一步研究。
Deberdt P等[10]研究指出由P. megakarya引起的可可黑果病的发病率与降雨量之间呈显著正相关，但未明确气温和湿度与该病发病率之间的相关性大小。本文研究结果表明，在海南，可可黑果病发病率与降雨量之间具有很强的相关性（r=0.76～0.95），降雨量越多，发病率越高；发病率与相对湿度之间的相关性为中等（r=0.43～0.74）；发病率与气温之间呈弱相关（r=0.19～0.32）。在海南，可可几乎周年都可开花，但以每年5～11月开花最多（占全年的94%左右），从开花到结成幼果将近2个月时间，因此7～11月正是幼果期集中的时期，而8～11月恰逢高温多雨和台风雨季节，因此可可黑果病的发病高峰期与幼果期相对一致，这也说明该病菌主要侵染幼果。在生产上建议在每年8月中下旬雨季来临前，全园进行可可黑果病预防，否则严重时可导致40%以上的可可幼果腐烂脱落，严重影响产量。
本次将菌株kk6a在PDA平板上进行单株培养及与Phytophthora palmivora A1、A2标准菌株进行配对培养，都未发现有性器官产生，可能是本研究所获得的菌株丧失了育性或育性较弱。ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，已有的研究结果表明，ITS在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息。本研究采用分子生物学方法对海南可可黑果病致病菌kk6a的核糖体DNA-ITS序列进行分析，其核糖体DNA-ITS序列与柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）的同源性为100%，从分子生物学水平上进一步鉴定菌株kk6a为柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。
参考文献
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