探讨全长型脾酪氨酸激酶[full length spleen tyrosine kinase, Syk(L)]基因转染对喉癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。
方法构建Syk(L)基因真核表达载体pIRES2－EGFP－Syk(L)，测序验证正确后，用脂质体介导法及G418筛选法，分别建立转染pIRES2－EGFP－Syk(L)载体和pIRES2－EGFP空白载体的喉癌细胞系Hep－2－Syk(L)及Hep－2－neo细胞。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，Q－RT－PCR)及蛋白印迹法(Western Blot)分析转染细胞Hep－2－Syk(L)、Hep－2－neo及未转染细胞Hep－2的Syk(L)mRNA及蛋白表达水平；采用CCK－8实验、Transwell实验、裸鼠成瘤实验分别检测转染细胞及未转染细胞的体外增殖能力、侵袭能力、体内成瘤能力。采用SPSS 18.0统计软件中的方差分析进行组间样本均数的比较。
结果成功构建了Syk(L)基因真核表达载体pIRES2－EGFP－SyK(L)；成功建立分别稳定转染pIRES2－EGFP－Syk(L)载体、pIRES2－EGFP空白载体的Hep－2－Syk(L)、Hep－2－neo细胞系；Q－RT－PCR结果显示Hep－2－Syk(L)细胞Syk(L)mRNA表达水平明显高于Hep－2－neo及Hep－2细胞(相对表达量2－ΔΔCT分别为28.395±0.067、3.891±0.021及1.005±0.012)，差异有统计学意义(F＝104.02，P<0.01)；Western Blot结果提示Hep－2－Syk(L)细胞Syk(L)相对蛋白含量为(0.821±0.047)，明显高于Hep－2－neo细胞的(0.558±0.031)和Hep－2细胞的(0.468±0.031)，差异有统计学意义(F＝112.32，P<0.01); CCK－8实验72 h Hep－2－Syk(L)细胞的平均吸光度值为1.390±0.067，低于Hep－2－neo细胞的1.830±0.067和Hep－2细胞的1.920±0.040，差异有统计学意义(F＝107.64，P<0.01)；Transwell实验中，Hep－2－Syk(L)组每个视野的平均侵袭细胞数目为(176.04±22.32)个，较Hep－2－neo组的(301.02±21.45)个、Hep－2组的(336.04±26.01)个明显减少，差异有统计学意义(F＝123.46，P<0.01)；裸鼠成瘤实验中，Hep－2－Syk(L)细胞组体内移植瘤生长受到抑制，平均体积为(250.77±34.83)mm3，低于Hep－2－neo组的肿瘤平均体积(750.77±40.83)mm3及Hep－2组的肿瘤平均体积(770.77±30.83)mm3差异有统计学意义(F＝165.78，P<0.01)。
结论喉癌细胞中Syk(L)低表达与细胞的恶性生物学行为相关，通过基因转染技术提高Syk(L)表达可以抑制喉癌细胞的恶性生物学行为，Syk(L)可能成为喉鳞癌基因治疗良好的干预靶点。