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摘 要：选择最佳纤维素固定化脂肪酶降解废弃油脂，缓解生活中厨余废水问题，作者以壳聚糖，羟丙基甲基纤维素和海藻酸钠-羧甲基纤维素钠为载体，研究偶联法是啊和包埋法固定化脂肪酶，并通过试验考察了不同载体固定脂肪酶固定化的效果。研究结果表明，包埋法固定化的脂肪酶的固定化效率高，但酶活回收率低，壳聚糖偶联法最优，固定化脂肪酶固定化率35%，酶回收率达72.6%。
关键词：壳聚糖;羟丙基甲基纤维素;海藻酸钠;脂肪酶;固定化
1 研究背景
脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），三酰基甘油酰基水解酶，能在油一水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、多肽等有机合成反应，是目前被重点研究的酶催化剂。随着研究的逐渐深入，脂肪酶因其催化效率高、清洁作用条件温和等特性，被广泛应用于污水处理、食品加工等领域，但游离脂肪酶存在易失活、不易回收、难重复使用等问题。而固定化酶可解决以上问题，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又呈现操作稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控和工艺简便等优点。
随着人们生活水平的提高，日趋严重的厨余垃圾油脂处理和分解问题亟待解决，固定化脂肪酶技术应用于环境保护引起了我们的关注。通过了解到该方面目前发展仍有一定的缺陷和不足，本研究希望通过固体材料利用物理吸附或化学结合的方式将脂肪酶富集于一定纤维素载体区域内，通过对比不同纤维素类载体，如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、壳聚糖，来研究它们的固定化的效果，研究不同作用条件下的区别，以脂肪酶的活性及回收率，选取最优条件下的方案，从而达到成本低，效率高，回收率高等效果，进而推及固定化脂肪酶应用于环境保护领域。
脂你版肪酶的固定因其可重复使用等优点近几年转变为酶工程重点研究对象，现已经提出物理吸附法、离子结合法、共价结合法、包埋法等多种方式，各有优劣，选择的载体也各不相同，本文考虑到衣物内的主要交联成分是纤维素，含量不稳定且已经过制衣厂一次加工，形态结构固定，难以参与脂肪酶固定反应。因此，将固定化载体选为更为本质、纯度更高的纤维素，其中羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、壳聚糖已有一定的酶固定化领域的基础，且都价格低廉、无毒。通过本次研究希望能为解决日趋严重的厨余垃圾油脂污染问题奠定基基础。
2 研究方法
2.1仪器
电子天平;温控摇床;紫外分光光度计;离心机;单道移液器;恒温摇床;加热型磁力搅拌器;脱色摇床。
2.2材料
脂肪酶，SIGMA;牛血清蛋白，ExCell;壳聚糖，98%六亚甲基二胺水溶液，SIGMA-ALORICH;25%戊二醛水溶液，0.1M磷酸钠缓冲液;羟丙基甲基纤维素，蒸馏水;无水氯化钙，海藻酸钠，2-丙醇溶剂，85%磷酸;95%乙醇，考马斯亮蓝试液，羧甲基纤维素钠，4-硝基苯丁酸酯。
2.3步骤
2.3.1脂肪酶的固定化
2.3.1.1壳聚糖-脂肪酶固定
將壳聚糖（3.9g）与50mL的2%六亚甲基二胺水溶液在室温下反应2小时[5]。 反应后，用离心机离心，取下层沉淀，用50mL5%戊二醛水溶液在室温下处理1小时， 逐次洗涤该物质。将处理后的酶溶液加入活化的壳聚糖沉淀中，置于摇床中搅拌反应3小时，在4-5℃下深度冷冻储存。
2.3.1.2羟丙基甲基纤维素-脂肪酶固定
将向盛有1.17g羟丙基甲基纤维素中加入100mL蒸馏水中，将所得溶液在摇床剧烈搅拌4-5小时充分溶解[2]。将处理后的酶液加入，得到的混合物在180rpm下搅拌60分钟，得到羟丙基甲基纤维素固定酶基质。基质倒入培养皿中，约5mm厚度。在37℃的烘箱中干燥约18小时， 形成羟丙基甲基纤维素固定化脂肪酶的白色薄膜，培养皿置于4-5℃下深度冷冻储存。
2.3.1.3羧甲基纤维素钠（海藻酸钠）-脂肪酶固定化
称取1g的海藻酸钠和0.25羧甲基纤维素钠，用加热磁力搅拌器100℃加热溶解，冷却后定容到100ml。用注射器将混合基质用针管逐滴加入0.1 mol/L CaCI2溶液中，固化30 min。最后，过滤并用蒸馏水洗净固定化颗粒，滤纸吸干水分后将颗粒置于4-5℃下深度冷冻储存。
2.3.2 固定率的计算
利用考马斯亮蓝法[4]测定蛋白质含量，并根据公式：固定率=固定化脂肪酶上蛋白质量/固定前游离酶液中蛋白含量，分别计算三种载体固定率。
2.3.3脂肪酶的活力测定[2]
利用分光光度计在405nm处测定三种固定化脂肪酶的吸光度，并采取公式：U=[△A/（0.01×t）]×D计算三种固定化脂肪酶的活力，其中U为酶活力;△A是反应时间内吸光值的变化;t为反应时间（min）;D为稀释倍数。
3 研究结果
3.1脂肪酶的固定化
羧甲基纤维素钠（海藻酸钠）-脂肪酶固定化凝胶颗为直径为2mm的淡黄色透明胶状小球，不溶于水（图1a）;壳聚糖-脂肪酶固定化凝胶呈橙黄色固体（图1b），不易溶于水，无特殊气味;羟丙基甲基纤维素-脂肪酶固定化凝胶呈淡黄色薄膜（图1c）。
图1三种脂肪酶固化物
3.2考马斯亮蓝测定蛋白含量计算固定效率
数据及计算结果如表1。
3.3固定化脂肪酶的活力
3.4固定化壳聚糖-脂肪酶填充柱
根据固定率和回收率的测定结果，壳聚糖固定化是实验三种载体中的最优材料，故选择壳聚糖固定化脂肪酶作为填充物质来设计脂肪酶填充柱用于家庭厨余废水处理（图3）。
4结果分析
4.1壳聚糖固定化脂肪酶回收率最高
壳聚糖固定化脂肪酶在固定时形成作用力较强的化学共价键，不易受到外界因素干扰而断裂，回收率高，约为0.726。且共价键不在酶的活性中心，不影响脂肪酶的作用效果。脂肪酶结合在壳聚糖表面，易与底物充分反应，活力可高达1.95，作用效果好。而羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素固定化脂肪酶是作用力较弱的物理结合，易遭到外力破坏，难以回收。羧甲基纤维素钠固定脂肪酶形成囊状结构，而羟丙基纤维素固定脂肪酶形成固态薄膜，脂肪酶包被在载体内部，阻碍其与底物反应，作用效果不佳。 4.2羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素固定化脂肪酶的固定率高于壳聚糖
长链的海藻酸钠分子在钙离子的交联作用下聚在一起，形成不溶于水的凝胶球，将水中作为溶质的脂肪酶被完全包起来，使上清液中几乎无游离脂肪酶，因此固定率高。
羟丙基纤维素固定化脂肪酶同样是胶状物质，脱水后形成硬膜使酶被封存，原游离酶溶液中的酶分子都被限制在薄膜内部，仅有水分子以蒸发的形式散出，体现出羟丙基纤维素作为载体固定率高。
壳聚糖的固定率较低，约为0.35。壳聚糖与六亚甲基二胺反应，得到大量羟基和氨基，促进其以共价方式将酶固定于其氨基或羟基上，但反应时间不足，液体中残留了游离酶。且反应受外界条件和自身的限制，共价键结合的壳聚糖无法脱离液相，也造成壳聚糖固定率低。
4.3固定化壳聚糖-脂肪酶填充柱适用于厨余污水处理
在脂肪酶参与反应方面，由于固定化壳聚糖脂肪酶呈固态且颗粒直径较小，既延缓了水分子通过，让酯类水解反应充分进行，保证了脂肪酶催化效果，同时也不会堵塞出口，使厨余水中的甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸，降低水环境污染，减轻污水处理厂的负担。
装置使用方面，流出液澄澈，不会污染水源。主要因为固定化酶的直径刚好大于滤网，不会有颗粒物渗出，同时活化后的壳聚糖自身稳定，不易受环境影响而褪色。装置类似层析柱，可接入家庭出水管道或是小范围内出水总管道中，可大规模生产使用。
5 研究结论
羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠作为载体的酶固定率略优于壳聚糖，但回收率低;壳聚糖固定化脂肪酶固定率为35%，回收率达72.6%，因此，固定化壳聚糖-脂肪酶填充柱有较好的实用性和推广性。
参考文献：
[1]杨桂兰、郭学平，Lowry 法和 Bradford 法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较， 中国生化药物杂志，2003年第24卷第3期.
[2]Fabr1′cio M. Gomes， Ernandes B. Pereira， and Heizir F. de Castro，Immobilization of Lipase on Chitin and Its Use，Biomacromolecules， Vol. 5， No. 1， 2004.
[3]虞鳳惠、马韵升等，海藻酸钠与羧甲基纤维素钠固定化高温碱性脂肪酶，中国酿造，2015年第34卷第5期.
关键词：壳聚糖;羟丙基甲基纤维素;海藻酸钠;脂肪酶;固定化
1 研究背景
脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），三酰基甘油酰基水解酶，能在油一水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、多肽等有机合成反应，是目前被重点研究的酶催化剂。随着研究的逐渐深入，脂肪酶因其催化效率高、清洁作用条件温和等特性，被广泛应用于污水处理、食品加工等领域，但游离脂肪酶存在易失活、不易回收、难重复使用等问题。而固定化酶可解决以上问题，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又呈现操作稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控和工艺简便等优点。
随着人们生活水平的提高，日趋严重的厨余垃圾油脂处理和分解问题亟待解决，固定化脂肪酶技术应用于环境保护引起了我们的关注。通过了解到该方面目前发展仍有一定的缺陷和不足，本研究希望通过固体材料利用物理吸附或化学结合的方式将脂肪酶富集于一定纤维素载体区域内，通过对比不同纤维素类载体，如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、壳聚糖，来研究它们的固定化的效果，研究不同作用条件下的区别，以脂肪酶的活性及回收率，选取最优条件下的方案，从而达到成本低，效率高，回收率高等效果，进而推及固定化脂肪酶应用于环境保护领域。
脂你版肪酶的固定因其可重复使用等优点近几年转变为酶工程重点研究对象，现已经提出物理吸附法、离子结合法、共价结合法、包埋法等多种方式，各有优劣，选择的载体也各不相同，本文考虑到衣物内的主要交联成分是纤维素，含量不稳定且已经过制衣厂一次加工，形态结构固定，难以参与脂肪酶固定反应。因此，将固定化载体选为更为本质、纯度更高的纤维素，其中羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、壳聚糖已有一定的酶固定化领域的基础，且都价格低廉、无毒。通过本次研究希望能为解决日趋严重的厨余垃圾油脂污染问题奠定基基础。
2 研究方法
2.1仪器
电子天平;温控摇床;紫外分光光度计;离心机;单道移液器;恒温摇床;加热型磁力搅拌器;脱色摇床。
2.2材料
脂肪酶，SIGMA;牛血清蛋白，ExCell;壳聚糖，98%六亚甲基二胺水溶液，SIGMA-ALORICH;25%戊二醛水溶液，0.1M磷酸钠缓冲液;羟丙基甲基纤维素，蒸馏水;无水氯化钙，海藻酸钠，2-丙醇溶剂，85%磷酸;95%乙醇，考马斯亮蓝试液，羧甲基纤维素钠，4-硝基苯丁酸酯。
2.3步骤
2.3.1脂肪酶的固定化
2.3.1.1壳聚糖-脂肪酶固定
將壳聚糖（3.9g）与50mL的2%六亚甲基二胺水溶液在室温下反应2小时[5]。 反应后，用离心机离心，取下层沉淀，用50mL5%戊二醛水溶液在室温下处理1小时， 逐次洗涤该物质。将处理后的酶溶液加入活化的壳聚糖沉淀中，置于摇床中搅拌反应3小时，在4-5℃下深度冷冻储存。
2.3.1.2羟丙基甲基纤维素-脂肪酶固定
将向盛有1.17g羟丙基甲基纤维素中加入100mL蒸馏水中，将所得溶液在摇床剧烈搅拌4-5小时充分溶解[2]。将处理后的酶液加入，得到的混合物在180rpm下搅拌60分钟，得到羟丙基甲基纤维素固定酶基质。基质倒入培养皿中，约5mm厚度。在37℃的烘箱中干燥约18小时， 形成羟丙基甲基纤维素固定化脂肪酶的白色薄膜，培养皿置于4-5℃下深度冷冻储存。
2.3.1.3羧甲基纤维素钠（海藻酸钠）-脂肪酶固定化
称取1g的海藻酸钠和0.25羧甲基纤维素钠，用加热磁力搅拌器100℃加热溶解，冷却后定容到100ml。用注射器将混合基质用针管逐滴加入0.1 mol/L CaCI2溶液中，固化30 min。最后，过滤并用蒸馏水洗净固定化颗粒，滤纸吸干水分后将颗粒置于4-5℃下深度冷冻储存。
2.3.2 固定率的计算
利用考马斯亮蓝法[4]测定蛋白质含量，并根据公式：固定率=固定化脂肪酶上蛋白质量/固定前游离酶液中蛋白含量，分别计算三种载体固定率。
2.3.3脂肪酶的活力测定[2]
利用分光光度计在405nm处测定三种固定化脂肪酶的吸光度，并采取公式：U=[△A/（0.01×t）]×D计算三种固定化脂肪酶的活力，其中U为酶活力;△A是反应时间内吸光值的变化;t为反应时间（min）;D为稀释倍数。
3 研究结果
3.1脂肪酶的固定化
羧甲基纤维素钠（海藻酸钠）-脂肪酶固定化凝胶颗为直径为2mm的淡黄色透明胶状小球，不溶于水（图1a）;壳聚糖-脂肪酶固定化凝胶呈橙黄色固体（图1b），不易溶于水，无特殊气味;羟丙基甲基纤维素-脂肪酶固定化凝胶呈淡黄色薄膜（图1c）。
图1三种脂肪酶固化物
3.2考马斯亮蓝测定蛋白含量计算固定效率
数据及计算结果如表1。
3.3固定化脂肪酶的活力
3.4固定化壳聚糖-脂肪酶填充柱
根据固定率和回收率的测定结果，壳聚糖固定化是实验三种载体中的最优材料，故选择壳聚糖固定化脂肪酶作为填充物质来设计脂肪酶填充柱用于家庭厨余废水处理（图3）。
4结果分析
4.1壳聚糖固定化脂肪酶回收率最高
壳聚糖固定化脂肪酶在固定时形成作用力较强的化学共价键，不易受到外界因素干扰而断裂，回收率高，约为0.726。且共价键不在酶的活性中心，不影响脂肪酶的作用效果。脂肪酶结合在壳聚糖表面，易与底物充分反应，活力可高达1.95，作用效果好。而羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素固定化脂肪酶是作用力较弱的物理结合，易遭到外力破坏，难以回收。羧甲基纤维素钠固定脂肪酶形成囊状结构，而羟丙基纤维素固定脂肪酶形成固态薄膜，脂肪酶包被在载体内部，阻碍其与底物反应，作用效果不佳。 4.2羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素固定化脂肪酶的固定率高于壳聚糖
长链的海藻酸钠分子在钙离子的交联作用下聚在一起，形成不溶于水的凝胶球，将水中作为溶质的脂肪酶被完全包起来，使上清液中几乎无游离脂肪酶，因此固定率高。
羟丙基纤维素固定化脂肪酶同样是胶状物质，脱水后形成硬膜使酶被封存，原游离酶溶液中的酶分子都被限制在薄膜内部，仅有水分子以蒸发的形式散出，体现出羟丙基纤维素作为载体固定率高。
壳聚糖的固定率较低，约为0.35。壳聚糖与六亚甲基二胺反应，得到大量羟基和氨基，促进其以共价方式将酶固定于其氨基或羟基上，但反应时间不足，液体中残留了游离酶。且反应受外界条件和自身的限制，共价键结合的壳聚糖无法脱离液相，也造成壳聚糖固定率低。
4.3固定化壳聚糖-脂肪酶填充柱适用于厨余污水处理
在脂肪酶参与反应方面，由于固定化壳聚糖脂肪酶呈固态且颗粒直径较小，既延缓了水分子通过，让酯类水解反应充分进行，保证了脂肪酶催化效果，同时也不会堵塞出口，使厨余水中的甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸，降低水环境污染，减轻污水处理厂的负担。
装置使用方面，流出液澄澈，不会污染水源。主要因为固定化酶的直径刚好大于滤网，不会有颗粒物渗出，同时活化后的壳聚糖自身稳定，不易受环境影响而褪色。装置类似层析柱，可接入家庭出水管道或是小范围内出水总管道中，可大规模生产使用。
5 研究结论
羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠作为载体的酶固定率略优于壳聚糖，但回收率低;壳聚糖固定化脂肪酶固定率为35%，回收率达72.6%，因此，固定化壳聚糖-脂肪酶填充柱有较好的实用性和推广性。
参考文献：
[1]杨桂兰、郭学平，Lowry 法和 Bradford 法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较， 中国生化药物杂志，2003年第24卷第3期.
[2]Fabr1′cio M. Gomes， Ernandes B. Pereira， and Heizir F. de Castro，Immobilization of Lipase on Chitin and Its Use，Biomacromolecules， Vol. 5， No. 1， 2004.
[3]虞鳳惠、马韵升等，海藻酸钠与羧甲基纤维素钠固定化高温碱性脂肪酶，中国酿造，2015年第34卷第5期.