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摘要[目的] 研制兔病毒性出血症新型疫苗。[方法]分别以黄芪多糖、蜂胶、铝胶、生理盐水为佐剂，研制兔病毒性出血症黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗，并从安全、免疫效果等方面对这4种疫苗进行比较。[结果] 4种疫苗均有良好的安全性。免疫后7 d 4种疫苗产生的特异性抗体效价均逐步升高，攻毒保护率均达到100%。免疫后14 d黄芪多糖佐剂抗体效价显著高于蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗。免疫后180 d黄芪多糖佐剂疫苗的保护率达75%，蜂胶佐剂与铝胶佐剂可达到50%，常规灭活疫苗的保护率达25%。[结论] 这4种疫苗均具有良好的安全性和免疫原性，其中黄芪多糖灭活苗的免疫效果最好。
关键词兔病毒性出血症；黄芪多糖；蜂胶；铝胶；灭活疫苗；免疫效果
中图分类号S829.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03573-03
基金项目青海省大通县农技推广补助项目。
作者简介权英存（1983- ），女，青海大通人，助理兽医师，从事动物医学方面的研究。
兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病[1-2]，该疾病传播速度快、发病率和死亡率均较高，兔群一旦感染该病，将造成毁灭性灾难，是危害养兔业健康发展的头号杀手[3]。该病首次爆发于我国江苏地区[4]，现已呈世界范围内流行，给全球的养兔业带来了巨大的经济损失[5-7]。目前，国内对该病的防控主要使用常规灭活疫苗进行免疫接种，随着对动物免疫增强剂研究的不断深入，黄芪多糖、蜂胶等具有抗菌、消炎、增强机体免疫功能等生物学功能的纯天然药物不断得到开发和应用[8-11]。笔者用黄芪多糖和蜂胶作为疫苗佐剂，制备RHDV灭活疫苗，并比较RHDV黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗的免疫效果，以期为黄芪多糖和蜂胶在动物疫苗佐剂中的开发和应用奠定基础，为RHDV新型疫苗的研制开发和应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1病毒与试验兔兔病毒性出血症病毒（组织毒）由青海畜牧兽医职业技术学院实验室分离并保存；未免疫过兔病毒性出血症病毒疫苗的健康易感兔购自青海民和绿之苑兔业有限公司下属养殖场。
1.2佐剂黄芪多糖购自西安康威生物工程有限公司；蜂胶购自青海门源蜂产品公司。
1.3兔病毒性出血症病毒灭活抗原的制备与检验
1.3.1灭活抗原的制备。将兔病毒性出血症病毒（组织毒）与灭菌生理盐水（质量体积比约为1∶4）充分研磨捣碎，经颈部皮下注射2月龄健康易感兔，每只注射2 ml，无菌取攻毒后24～72 h死亡兔的肝脏组织与灭菌生理盐水（质量体积比约为1∶4）充分研磨捣碎，经甲醛灭活后，4 ℃下保存备用。
1.3.2灭活抗原的检验。按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行灭活抗原对人“O”型红细胞凝集效价的测定和细菌、霉菌、支原体的检测。
1.44种佐剂兔病毒性出血症灭活疫苗的制备
1.4.1蜂胶佐剂灭活疫苗的制备。将蜂胶碾碎过20目药筛后，与无水乙醇（质量体积比约为1∶4）充分混合，置于37 ℃下作用48 h，取上清液即为纯化的蜂胶乙醇浸液。将兔病毒性出血症灭活抗原与蜂胶乙醇浸液按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症蜂胶佐剂灭活疫苗。
1.4.2黄芪多糖佐剂灭活疫苗的制备。将黄芪多糖用蒸馏水配制成浓度25 mg/ml的溶液，高压蒸汽灭菌，即得黄芪多糖佐剂。将兔病毒性出血症灭活抗原与黄芪多糖佐剂按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症黄芪多糖佐剂灭活疫苗。
1.4.3铝胶佐剂灭活疫苗的制备。将三氯化铝用蒸馏水配制成8%的溶液，加温至56～60 ℃，用氢氧化钠溶液缓慢调节pH至5.6～6.0，高压蒸汽灭菌，即得铝胶佐剂。将兔病毒性出血症灭活抗原与铝胶佐剂按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症铝胶佐剂灭活疫苗。
1.4.4常规灭活疫苗的制备。将兔病毒性出血症灭活抗原与灭菌生理盐水等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症常规灭活疫苗。
1.54种疫苗的物理性状检验按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗的剂型、稳定性等物理性状检验。
1.64种疫苗的无菌检验按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗的细菌、霉菌、支原体的检测。
1.74种疫苗的安全性检验分别将兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗经颈部皮下各注射健康易感兔10只，注射劑量为4 ml/只，观察10 d，免疫兔应无任何不良反应。
1.84种疫苗的效力检验
1.8.1试验设计与分组。将120只健康易感家兔随机分为5组（对照组、试验I组、试验II组、试验III组、试验IV组），每组24只。试验I组、II组、III组、IV组分别免疫兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗，剂量为1 ml/只，对照组免疫灭菌生理盐水。
1.8.24种疫苗抗体效价的比较。分别在免疫后7、14、28、60、90、180 d从每组中随机抽取4只试验兔于耳静脉采血后分离血清，通过血凝抑制试验（HI）测定血清中兔病毒性出血症抗体效价。使用SPSS软件对试验数据进行统计与方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。
关键词兔病毒性出血症；黄芪多糖；蜂胶；铝胶；灭活疫苗；免疫效果
中图分类号S829.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03573-03
基金项目青海省大通县农技推广补助项目。
作者简介权英存（1983- ），女，青海大通人，助理兽医师，从事动物医学方面的研究。
兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病[1-2]，该疾病传播速度快、发病率和死亡率均较高，兔群一旦感染该病，将造成毁灭性灾难，是危害养兔业健康发展的头号杀手[3]。该病首次爆发于我国江苏地区[4]，现已呈世界范围内流行，给全球的养兔业带来了巨大的经济损失[5-7]。目前，国内对该病的防控主要使用常规灭活疫苗进行免疫接种，随着对动物免疫增强剂研究的不断深入，黄芪多糖、蜂胶等具有抗菌、消炎、增强机体免疫功能等生物学功能的纯天然药物不断得到开发和应用[8-11]。笔者用黄芪多糖和蜂胶作为疫苗佐剂，制备RHDV灭活疫苗，并比较RHDV黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗的免疫效果，以期为黄芪多糖和蜂胶在动物疫苗佐剂中的开发和应用奠定基础，为RHDV新型疫苗的研制开发和应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1病毒与试验兔兔病毒性出血症病毒（组织毒）由青海畜牧兽医职业技术学院实验室分离并保存；未免疫过兔病毒性出血症病毒疫苗的健康易感兔购自青海民和绿之苑兔业有限公司下属养殖场。
1.2佐剂黄芪多糖购自西安康威生物工程有限公司；蜂胶购自青海门源蜂产品公司。
1.3兔病毒性出血症病毒灭活抗原的制备与检验
1.3.1灭活抗原的制备。将兔病毒性出血症病毒（组织毒）与灭菌生理盐水（质量体积比约为1∶4）充分研磨捣碎，经颈部皮下注射2月龄健康易感兔，每只注射2 ml，无菌取攻毒后24～72 h死亡兔的肝脏组织与灭菌生理盐水（质量体积比约为1∶4）充分研磨捣碎，经甲醛灭活后，4 ℃下保存备用。
1.3.2灭活抗原的检验。按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行灭活抗原对人“O”型红细胞凝集效价的测定和细菌、霉菌、支原体的检测。
1.44种佐剂兔病毒性出血症灭活疫苗的制备
1.4.1蜂胶佐剂灭活疫苗的制备。将蜂胶碾碎过20目药筛后，与无水乙醇（质量体积比约为1∶4）充分混合，置于37 ℃下作用48 h，取上清液即为纯化的蜂胶乙醇浸液。将兔病毒性出血症灭活抗原与蜂胶乙醇浸液按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症蜂胶佐剂灭活疫苗。
1.4.2黄芪多糖佐剂灭活疫苗的制备。将黄芪多糖用蒸馏水配制成浓度25 mg/ml的溶液，高压蒸汽灭菌，即得黄芪多糖佐剂。将兔病毒性出血症灭活抗原与黄芪多糖佐剂按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症黄芪多糖佐剂灭活疫苗。
1.4.3铝胶佐剂灭活疫苗的制备。将三氯化铝用蒸馏水配制成8%的溶液，加温至56～60 ℃，用氢氧化钠溶液缓慢调节pH至5.6～6.0，高压蒸汽灭菌，即得铝胶佐剂。将兔病毒性出血症灭活抗原与铝胶佐剂按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症铝胶佐剂灭活疫苗。
1.4.4常规灭活疫苗的制备。将兔病毒性出血症灭活抗原与灭菌生理盐水等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症常规灭活疫苗。
1.54种疫苗的物理性状检验按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗的剂型、稳定性等物理性状检验。
1.64种疫苗的无菌检验按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗的细菌、霉菌、支原体的检测。
1.74种疫苗的安全性检验分别将兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗经颈部皮下各注射健康易感兔10只，注射劑量为4 ml/只，观察10 d，免疫兔应无任何不良反应。
1.84种疫苗的效力检验
1.8.1试验设计与分组。将120只健康易感家兔随机分为5组（对照组、试验I组、试验II组、试验III组、试验IV组），每组24只。试验I组、II组、III组、IV组分别免疫兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗，剂量为1 ml/只，对照组免疫灭菌生理盐水。
1.8.24种疫苗抗体效价的比较。分别在免疫后7、14、28、60、90、180 d从每组中随机抽取4只试验兔于耳静脉采血后分离血清，通过血凝抑制试验（HI）测定血清中兔病毒性出血症抗体效价。使用SPSS软件对试验数据进行统计与方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。