论文部分内容阅读
摘要 从扎朗县扎其乡采集青稞细菌性病害典型病株，通过菌物的分离与纯化，按照柯赫氏法则进行致病性测定及菌株鉴定。结果表明，该菌物为黄单孢杆菌属细菌。
关键词 青稞；细菌性病害；病原菌；分离；鉴定
中图分类号 S432.4 2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）08-0095-02
Isolation and Identification of Highland Barley Bacterial Pathogens
YAO Xiao-bo WANG Wen-feng WANG Cui-ling * ZHA Luo LI Yang LEI Xue-ping LIU He-chun ZHUO Ga
（Plant Protection Research Department，Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa Tibet 850032）
Abstract The typical pathogens of highland barley bacterial disease were collected from Zhaqi Town of Zhalang County，The pathogens were isolated and purified，by Koch′s Rule pathogenicity determination and strain identification were made.The results showed that the pathogen was identified as a microorganism of Xanthomonas genus.
Key words highland barley；bacterial disease；pathogens；isolation；identification
青稞（Hordeumvulgare L.var.nudum Hook.f.）俗稱裸大麦，又称元麦，属于禾本科植物[1]。青稞主要分布在海拔4 200～4 500 m的青藏高寒地区[2]，例如西藏、青海、云南的迪庆、甘肃的甘南州，以及四川的甘孜州和阿坝州等。青稞是藏区农牧民不可替代的主粮，也是藏区主要饲料和酿造业等农产品加工业的重要原料，西藏青稞播种面积达13.3万hm2左右。从扎朗县扎其乡采集一株典型的细菌性病害病株，叶片黄化，呈暗绿色水渍状或油渍状小斑，并有黄色颗粒状细菌溢液，根及茎基部出现褐腐，对其进行分离、致病性测定和菌物鉴定。现将鉴定结果报道如下，以为青稞病害的防治提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 青稞细菌病害标本的采集。2016年7月，在山南扎朗县扎其乡采集到本研究的供试样本，所采样本青稞品种为藏青2000。
1.1.2 培养基制备。试验选用PDA培养基[3]。培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖10～20 g、琼胶17～20 g、水1 000 mL。将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，用纱布滤去马铃薯，加水补足1 000 mL。调pH值为7.4～7.6。加入糖和琼胶，加热使琼胶完全溶化后，趁热用纱布过滤，分装试管。加棉花塞，用高压灭菌锅灭菌20～30 min。将培养基放于28 ℃的恒温箱培养72 h。观察有无微生物的生长，对无菌的培养基，保存在2～4 ℃冰箱内待用。
1.2 试验方法
1.2.1 发病部位微生物的分离。剪取病、健交界处2～3 mm长的病组织，用70%乙醇消毒30 s，用0.1%升汞消毒3 min，用无菌水洗3次，最后将病组织直接移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，将接菌的PDA平板倒置于20～25 ℃恒温培养箱中，待菌落长出后挑取边缘菌物转接到新的PDA平板上，在25 ℃恒温培养箱中进行纯化培养[1-3]。在无菌条件下用接种环挑取菌物，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3～4条。转动培养皿约70°，并烧掉接种环上的剩余物，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线[4-5]。用同样的方法通过第2次划线部分作第3次划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于恒温箱培养[6]。
1.2.2 菌物致病性鉴定。采用柯赫氏法则进行致病性鉴定[4]。将分离的菌物，经肉汁胨琼胶培养基培养2～3 d，然后用接种针从琼胶斜面上挑取少许细菌，采用穿刺法接种到盆栽青稞藏青2000的叶片上，通过套塑料袋进行保温、保湿观察发病症状。
1.2.3 菌物的形态学鉴定。①革兰氏染色反应。用接种环取菌物涂于载玻片上，把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤。用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过3次固定。将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。水洗后加芦戈氏碘液处理（媒染）1 min。水洗后用95%酒精脱色，脱色时频频摇动玻片[5]，直至流下的液体无色为止（需30 s左右）。水洗后加石炭酸复红稀释液染色（复染）30 s。水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检[5]。②鞭毛染色反应。将玻片放入洗衣粉过滤液中煮沸20 min，冷却自来水冲洗晾干，浓洗液中浸泡5～6 d，自来水冲去残酸，沥干水分，放入95%乙醇中脱水。加1滴GENMED清理液（Reagent A）在载玻片的一端，用无菌接种环轻轻点触分离的菌落再轻轻点触在载玻片一端的GENMED清理液（Reagent A）倾斜载玻片，使含有细菌的GENMED清理液（ReagentA）顺势流向另一端[6]。室温下晾干载玻片加入GENMED染色液（Reagent B），室温下处理5 min，避免光照小心移去GENMED染色液（Reagent B），加上GENMED清理液（ReagentA），小心移去GENMED清理液（Reagent A），重复上述试验步骤3～5次，直至染色液洗去，晾干载玻片于油镜下观察。
1.3 菌物的鉴定
依据《柏杰氏细菌鉴定手册》，参照植物病原细菌有关的5个属的主要性状进行鉴定[5-6]。结果如表1所示。
2 结果与分析
2.1 菌物的培养性状
通过平板划线分离法，分离菌物呈淡黄色、透明、表面光滑（图1）。
2.2 菌物的致病性鉴定
经1周左右保温、保湿培养，得到的症状为叶片黄化，呈暗绿色水渍状或油渍状小斑，与田间症状相似，分离的菌物为致病菌。
2.3 病原物的形态学鉴定
通过革兰氏染色，菌物呈淡红色，阴性菌，短杆状，多单生，少双生。经过鞭毛染色菌体极生一根鞭毛，呈不透明紫蓝色，鞭毛也呈不透明紫蓝色（图3），则鉴定菌物为黄单孢杆菌属细菌。
3 结论与讨论
青稞的病害组织在分离培养过程中分离出其他2种菌物。但是经过多次回接后发现并没有形成与病害一致的症状，无致病性，并不是青稞细菌病害的病原菌。这有可能是在分离纯化过程中病原菌被杂菌污染造成的，也可能是腐生菌。目前对青稞细菌病害的研究较少，通过分离鉴定青稞细菌性病害的致病菌物，为病害的下一步诊断提供了理论依据，也为今后病害防治提供了技术保障。
4 参考文献
[1] 谢宗万.本草纲目药物彩色图鉴[M].1版.北京：人民卫生出版社，2001.
[2] 马得泉，洛桑更堆.西藏栽培大麦分类研究进展[J].西藏科技，1997（1）：2-8.
[3] 方中达.植病研究方法[M].北京：农业出版社，1979：116-117.
[4] 王海芸.青稞主要病害及防治技术[J].现代农业，2012（7）：29.
[5] 姚小波.青稞细菌性条斑病的诊断技术研究[J].西藏农业科技，2015（1）：37-41.
[6] 微生物染色技术[EB/OL].[2017-02-04].https：//wenku.baidu.com/view/91b940e281c758f5f61f6771.html.
关键词 青稞；细菌性病害；病原菌；分离；鉴定
中图分类号 S432.4 2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）08-0095-02
Isolation and Identification of Highland Barley Bacterial Pathogens
YAO Xiao-bo WANG Wen-feng WANG Cui-ling * ZHA Luo LI Yang LEI Xue-ping LIU He-chun ZHUO Ga
（Plant Protection Research Department，Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa Tibet 850032）
Abstract The typical pathogens of highland barley bacterial disease were collected from Zhaqi Town of Zhalang County，The pathogens were isolated and purified，by Koch′s Rule pathogenicity determination and strain identification were made.The results showed that the pathogen was identified as a microorganism of Xanthomonas genus.
Key words highland barley；bacterial disease；pathogens；isolation；identification
青稞（Hordeumvulgare L.var.nudum Hook.f.）俗稱裸大麦，又称元麦，属于禾本科植物[1]。青稞主要分布在海拔4 200～4 500 m的青藏高寒地区[2]，例如西藏、青海、云南的迪庆、甘肃的甘南州，以及四川的甘孜州和阿坝州等。青稞是藏区农牧民不可替代的主粮，也是藏区主要饲料和酿造业等农产品加工业的重要原料，西藏青稞播种面积达13.3万hm2左右。从扎朗县扎其乡采集一株典型的细菌性病害病株，叶片黄化，呈暗绿色水渍状或油渍状小斑，并有黄色颗粒状细菌溢液，根及茎基部出现褐腐，对其进行分离、致病性测定和菌物鉴定。现将鉴定结果报道如下，以为青稞病害的防治提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 青稞细菌病害标本的采集。2016年7月，在山南扎朗县扎其乡采集到本研究的供试样本，所采样本青稞品种为藏青2000。
1.1.2 培养基制备。试验选用PDA培养基[3]。培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖10～20 g、琼胶17～20 g、水1 000 mL。将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，用纱布滤去马铃薯，加水补足1 000 mL。调pH值为7.4～7.6。加入糖和琼胶，加热使琼胶完全溶化后，趁热用纱布过滤，分装试管。加棉花塞，用高压灭菌锅灭菌20～30 min。将培养基放于28 ℃的恒温箱培养72 h。观察有无微生物的生长，对无菌的培养基，保存在2～4 ℃冰箱内待用。
1.2 试验方法
1.2.1 发病部位微生物的分离。剪取病、健交界处2～3 mm长的病组织，用70%乙醇消毒30 s，用0.1%升汞消毒3 min，用无菌水洗3次，最后将病组织直接移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，将接菌的PDA平板倒置于20～25 ℃恒温培养箱中，待菌落长出后挑取边缘菌物转接到新的PDA平板上，在25 ℃恒温培养箱中进行纯化培养[1-3]。在无菌条件下用接种环挑取菌物，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3～4条。转动培养皿约70°，并烧掉接种环上的剩余物，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线[4-5]。用同样的方法通过第2次划线部分作第3次划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于恒温箱培养[6]。
1.2.2 菌物致病性鉴定。采用柯赫氏法则进行致病性鉴定[4]。将分离的菌物，经肉汁胨琼胶培养基培养2～3 d，然后用接种针从琼胶斜面上挑取少许细菌，采用穿刺法接种到盆栽青稞藏青2000的叶片上，通过套塑料袋进行保温、保湿观察发病症状。
1.2.3 菌物的形态学鉴定。①革兰氏染色反应。用接种环取菌物涂于载玻片上，把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤。用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过3次固定。将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。水洗后加芦戈氏碘液处理（媒染）1 min。水洗后用95%酒精脱色，脱色时频频摇动玻片[5]，直至流下的液体无色为止（需30 s左右）。水洗后加石炭酸复红稀释液染色（复染）30 s。水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检[5]。②鞭毛染色反应。将玻片放入洗衣粉过滤液中煮沸20 min，冷却自来水冲洗晾干，浓洗液中浸泡5～6 d，自来水冲去残酸，沥干水分，放入95%乙醇中脱水。加1滴GENMED清理液（Reagent A）在载玻片的一端，用无菌接种环轻轻点触分离的菌落再轻轻点触在载玻片一端的GENMED清理液（Reagent A）倾斜载玻片，使含有细菌的GENMED清理液（ReagentA）顺势流向另一端[6]。室温下晾干载玻片加入GENMED染色液（Reagent B），室温下处理5 min，避免光照小心移去GENMED染色液（Reagent B），加上GENMED清理液（ReagentA），小心移去GENMED清理液（Reagent A），重复上述试验步骤3～5次，直至染色液洗去，晾干载玻片于油镜下观察。
1.3 菌物的鉴定
依据《柏杰氏细菌鉴定手册》，参照植物病原细菌有关的5个属的主要性状进行鉴定[5-6]。结果如表1所示。
2 结果与分析
2.1 菌物的培养性状
通过平板划线分离法，分离菌物呈淡黄色、透明、表面光滑（图1）。
2.2 菌物的致病性鉴定
经1周左右保温、保湿培养，得到的症状为叶片黄化，呈暗绿色水渍状或油渍状小斑，与田间症状相似，分离的菌物为致病菌。
2.3 病原物的形态学鉴定
通过革兰氏染色，菌物呈淡红色，阴性菌，短杆状，多单生，少双生。经过鞭毛染色菌体极生一根鞭毛，呈不透明紫蓝色，鞭毛也呈不透明紫蓝色（图3），则鉴定菌物为黄单孢杆菌属细菌。
3 结论与讨论
青稞的病害组织在分离培养过程中分离出其他2种菌物。但是经过多次回接后发现并没有形成与病害一致的症状，无致病性，并不是青稞细菌病害的病原菌。这有可能是在分离纯化过程中病原菌被杂菌污染造成的，也可能是腐生菌。目前对青稞细菌病害的研究较少，通过分离鉴定青稞细菌性病害的致病菌物，为病害的下一步诊断提供了理论依据，也为今后病害防治提供了技术保障。
4 参考文献
[1] 谢宗万.本草纲目药物彩色图鉴[M].1版.北京：人民卫生出版社，2001.
[2] 马得泉，洛桑更堆.西藏栽培大麦分类研究进展[J].西藏科技，1997（1）：2-8.
[3] 方中达.植病研究方法[M].北京：农业出版社，1979：116-117.
[4] 王海芸.青稞主要病害及防治技术[J].现代农业，2012（7）：29.
[5] 姚小波.青稞细菌性条斑病的诊断技术研究[J].西藏农业科技，2015（1）：37-41.
[6] 微生物染色技术[EB/OL].[2017-02-04].https：//wenku.baidu.com/view/91b940e281c758f5f61f6771.html.