论文部分内容阅读
【分类号】：R284
【摘要】 目的 建立脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定方法。方法 采用酸性染料比色法，以溴甲酚绿缓冲液作为生物碱的显色剂，测定样品溶液在417 nm波长处的吸收度。 结果 对照品川芎嗪质量浓度在0.031～0.153 mg/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系，r=0.9998。平均回收率为100.95%，RSD为1.75%。精密度和稳定性良好。结论 酸性染料比色法灵敏、快速、准确，可用于脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定。
【关键词】 脑脉通；总生物碱；酸性染料比色法
脑脉通由大黄﹑川芎﹑葛根等组成，具有解毒降浊﹑益气活血﹑涤痰开窍﹑泻下之功。该方治疗脑梗死效果明显，可明显改善生活质量，对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。为有效控制脑脉通的质量，本文采用酸性染料比色法测定该制剂中总生物碱的含量，方法简便、快速、准确性高、重现性好，为脑脉通的质量控制提供了可行的方法。
1 仪器与试药
METTLER-AE240型1/100000电子分析天平（瑞士梅特勒公司），RE52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV-2201SHIMADZU型分光光度计（日本岛津）。
大黄、川芎、葛根等药材购自河南省药材公司，经河南中医学院陈随清教授鉴定分别为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎，豆科植物野葛Pueraria lobata（Wild.） Ohwi的干燥根，伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。川芎嗪对照品（供含量测定用，批号：817-200104）购自中国药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
溴甲酚绿缓冲液的配制：精密称取溴甲酚绿125 mg，用0.2 mol/L的NaOH 12.5 mL溶解后，加入邻苯二甲酸氢钾2.55 g，加少量蒸馏水溶解后，转移至250 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释将至刻度，摇匀，0.2 mol/L的NaOH调pH4.8，備用。
脑脉通有效部位样品的制备：按照脑脉通处方比例称取药材粗粉，用10倍量Q%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，提取液用6倍量蒸馏水分散后，用大孔吸附树脂处理，P%乙醇洗脱至洗脱液约为树脂体积的8倍为止，即得有效部位样品。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取盐酸川芎嗪对照品6.10 mg至10 mL的容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，即得0.610 mg/mL的盐酸川芎嗪对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取有效部位样品0.3 g，加少量的水使溶解，超声2 min，再加入25%的盐酸使溶液的pH值为2～3，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层近无色，分取酸层，用氨水调溶液pH值9～10，再用三氯甲烷萃取5次（20，20，20，15，15 mL），合并三氯甲烷层，减压蒸干，三氯甲烷溶解转移至5 mL的容量瓶中，并稀释至刻度。
阴性样品溶液的制备：按处方比例分别称取除川芎外其他药材适量，按有效部位制备工艺制得缺川芎的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
2.2 测定波长的选择
精密吸取川芎嗪对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各1 mL分别置分液漏斗中，加入溴甲酚绿缓冲液7 mL和三氯甲烷10 mL振摇2 min，静置2 h，分取三氯甲烷层，并定容至10 mL。同法制得空白溶液。以空白为参比，400～700 nm范围内扫描测定吸收光谱，结果表明，样品与对照品均在417 nm处有最大吸收，故选择测定波长为417 nm。
2.3 显色条件的考察
2.3.1 缓冲溶液pH值的考察 精密吸取供试品溶液6份，每份1 mL，置分液漏斗中，分别加入pH3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、5.8 mL的溴甲酚绿缓冲液，按“2.2”项方法测定溶液的吸光度。结果表明，用pH值4.8的溴甲酚绿缓冲液显色，吸光度最大。
2.3.2 酸性染料用量考察 精密吸取供试品溶液5份，每份1 mL，分别加入溴甲酚绿缓冲液4、5、6、7 mL和8 mL，按“2.2”法测定吸光度。结果表明，溴甲酚绿缓冲液用量为7 mL时，已能使生物碱与其完全结合，被充分萃取，吸光度最大，再增加用量，反而会因空白溶液颜色加深，导致吸光度下降。
2.4 显色稳定性试验
取“2.2”项下显色后的供试品溶液，分别放置0、1、2、3、4 h后，于417 nm处测定吸光度，结果表明，三氯甲烷萃取液放置4 h内基本稳定，吸光度RSD为0.40%。
2.5 线性关系试验
精密吸取川芎嗪对照品溶液（0.61 mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL照“2.2”项下的方法于417 nm处测定吸光度。以川芎嗪对照品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程：C=0.2952A-0.0054（r=0.9998），表明川芎嗪在0.031～0.153 mg/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取川芎嗪对照品溶液（0.61 mg/mL）1 mL，按“2.2”项方法于417 nm连续测定6次，记录吸光度，计算RSD为0.53%，表明仪器精密度符合要求。
2.7 重复性试验
取5份同一批有效部位样品约0.3 g精密称定，按“2.1”项方法处理供试品溶液，按“2.2”项方法显色后于417 nm处测定吸光度，并计算含量的RSD为2.67%，表明样品制备和测定误差符合要求，本实验方法重复性良好。
2.8 样品稳定性的考察
取有效部位样品约0.3 g，精密称定，按“2.1”项方法制备样品溶液，分别于显色后0、2、4、6、8、10 h后，依法测定吸光度，计算其含量，结果表明溶液在8 h内稳定，RSD为1.11%。
2.9 回收率试验
取5份同一批有效部位样品各0.15 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.84 mg/mL的川芎嗪对照品溶液2 mL，低温干燥后，按“2.1”项方法制备样品溶液，再按“2.2”项下方法于415 nm处显色测定吸光度，计算其含量，结果总生物碱的平均回收率为100.95%，RSD为1.75%。
2.10 样品的含量测定
取3批有效部位样品，每份约0.3 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，最后定容至10 mL的容量瓶中。精密吸取供试品溶液1 mL，再按“2.2”项下方法于417 nm处显色测定吸光度，计算其含量。
3 讨论
3.1 酸性染料比色法是测定生物碱的常用方法之一，可用于川芎药材总生物碱的含量测定。我们通过参考相关文献，采用溴甲酚绿缓冲液作为生物碱的显色剂，并对显色剂的用量及显色的稳定性等影响因素均做了考察，筛选出最佳方案，可以在一定程度上保证测定结果的重现、稳定和准确可靠。
3.2 在测定过程中发现阴性样品在422 nm处有干扰，将pH调节为酸性质，再分别用乙醚和乙酸乙酯萃取，结果乙醚萃取阴性仍有干扰，而乙酸乙酯萃取阴性无干扰。故选择乙酸乙酯为萃取溶剂。
3.3 建立了脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定方法，3批样品的含量测定结果，脑脉通有效部位中总生物碱含量为1.09%～1.12%，转移率为75.19%～76.41%。
【摘要】 目的 建立脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定方法。方法 采用酸性染料比色法，以溴甲酚绿缓冲液作为生物碱的显色剂，测定样品溶液在417 nm波长处的吸收度。 结果 对照品川芎嗪质量浓度在0.031～0.153 mg/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系，r=0.9998。平均回收率为100.95%，RSD为1.75%。精密度和稳定性良好。结论 酸性染料比色法灵敏、快速、准确，可用于脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定。
【关键词】 脑脉通；总生物碱；酸性染料比色法
脑脉通由大黄﹑川芎﹑葛根等组成，具有解毒降浊﹑益气活血﹑涤痰开窍﹑泻下之功。该方治疗脑梗死效果明显，可明显改善生活质量，对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。为有效控制脑脉通的质量，本文采用酸性染料比色法测定该制剂中总生物碱的含量，方法简便、快速、准确性高、重现性好，为脑脉通的质量控制提供了可行的方法。
1 仪器与试药
METTLER-AE240型1/100000电子分析天平（瑞士梅特勒公司），RE52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV-2201SHIMADZU型分光光度计（日本岛津）。
大黄、川芎、葛根等药材购自河南省药材公司，经河南中医学院陈随清教授鉴定分别为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎，豆科植物野葛Pueraria lobata（Wild.） Ohwi的干燥根，伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。川芎嗪对照品（供含量测定用，批号：817-200104）购自中国药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
溴甲酚绿缓冲液的配制：精密称取溴甲酚绿125 mg，用0.2 mol/L的NaOH 12.5 mL溶解后，加入邻苯二甲酸氢钾2.55 g，加少量蒸馏水溶解后，转移至250 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释将至刻度，摇匀，0.2 mol/L的NaOH调pH4.8，備用。
脑脉通有效部位样品的制备：按照脑脉通处方比例称取药材粗粉，用10倍量Q%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，提取液用6倍量蒸馏水分散后，用大孔吸附树脂处理，P%乙醇洗脱至洗脱液约为树脂体积的8倍为止，即得有效部位样品。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取盐酸川芎嗪对照品6.10 mg至10 mL的容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，即得0.610 mg/mL的盐酸川芎嗪对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取有效部位样品0.3 g，加少量的水使溶解，超声2 min，再加入25%的盐酸使溶液的pH值为2～3，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层近无色，分取酸层，用氨水调溶液pH值9～10，再用三氯甲烷萃取5次（20，20，20，15，15 mL），合并三氯甲烷层，减压蒸干，三氯甲烷溶解转移至5 mL的容量瓶中，并稀释至刻度。
阴性样品溶液的制备：按处方比例分别称取除川芎外其他药材适量，按有效部位制备工艺制得缺川芎的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
2.2 测定波长的选择
精密吸取川芎嗪对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各1 mL分别置分液漏斗中，加入溴甲酚绿缓冲液7 mL和三氯甲烷10 mL振摇2 min，静置2 h，分取三氯甲烷层，并定容至10 mL。同法制得空白溶液。以空白为参比，400～700 nm范围内扫描测定吸收光谱，结果表明，样品与对照品均在417 nm处有最大吸收，故选择测定波长为417 nm。
2.3 显色条件的考察
2.3.1 缓冲溶液pH值的考察 精密吸取供试品溶液6份，每份1 mL，置分液漏斗中，分别加入pH3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、5.8 mL的溴甲酚绿缓冲液，按“2.2”项方法测定溶液的吸光度。结果表明，用pH值4.8的溴甲酚绿缓冲液显色，吸光度最大。
2.3.2 酸性染料用量考察 精密吸取供试品溶液5份，每份1 mL，分别加入溴甲酚绿缓冲液4、5、6、7 mL和8 mL，按“2.2”法测定吸光度。结果表明，溴甲酚绿缓冲液用量为7 mL时，已能使生物碱与其完全结合，被充分萃取，吸光度最大，再增加用量，反而会因空白溶液颜色加深，导致吸光度下降。
2.4 显色稳定性试验
取“2.2”项下显色后的供试品溶液，分别放置0、1、2、3、4 h后，于417 nm处测定吸光度，结果表明，三氯甲烷萃取液放置4 h内基本稳定，吸光度RSD为0.40%。
2.5 线性关系试验
精密吸取川芎嗪对照品溶液（0.61 mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL照“2.2”项下的方法于417 nm处测定吸光度。以川芎嗪对照品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程：C=0.2952A-0.0054（r=0.9998），表明川芎嗪在0.031～0.153 mg/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取川芎嗪对照品溶液（0.61 mg/mL）1 mL，按“2.2”项方法于417 nm连续测定6次，记录吸光度，计算RSD为0.53%，表明仪器精密度符合要求。
2.7 重复性试验
取5份同一批有效部位样品约0.3 g精密称定，按“2.1”项方法处理供试品溶液，按“2.2”项方法显色后于417 nm处测定吸光度，并计算含量的RSD为2.67%，表明样品制备和测定误差符合要求，本实验方法重复性良好。
2.8 样品稳定性的考察
取有效部位样品约0.3 g，精密称定，按“2.1”项方法制备样品溶液，分别于显色后0、2、4、6、8、10 h后，依法测定吸光度，计算其含量，结果表明溶液在8 h内稳定，RSD为1.11%。
2.9 回收率试验
取5份同一批有效部位样品各0.15 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.84 mg/mL的川芎嗪对照品溶液2 mL，低温干燥后，按“2.1”项方法制备样品溶液，再按“2.2”项下方法于415 nm处显色测定吸光度，计算其含量，结果总生物碱的平均回收率为100.95%，RSD为1.75%。
2.10 样品的含量测定
取3批有效部位样品，每份约0.3 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，最后定容至10 mL的容量瓶中。精密吸取供试品溶液1 mL，再按“2.2”项下方法于417 nm处显色测定吸光度，计算其含量。
3 讨论
3.1 酸性染料比色法是测定生物碱的常用方法之一，可用于川芎药材总生物碱的含量测定。我们通过参考相关文献，采用溴甲酚绿缓冲液作为生物碱的显色剂，并对显色剂的用量及显色的稳定性等影响因素均做了考察，筛选出最佳方案，可以在一定程度上保证测定结果的重现、稳定和准确可靠。
3.2 在测定过程中发现阴性样品在422 nm处有干扰，将pH调节为酸性质，再分别用乙醚和乙酸乙酯萃取，结果乙醚萃取阴性仍有干扰，而乙酸乙酯萃取阴性无干扰。故选择乙酸乙酯为萃取溶剂。
3.3 建立了脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定方法，3批样品的含量测定结果，脑脉通有效部位中总生物碱含量为1.09%～1.12%，转移率为75.19%～76.41%。