目的建立一种快速、准确的以咪达唑仑作为"探针药物"评价或测定细胞色素酶(CYP3A4)酶活性的高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)-紫外检测(UV detection,VWD)方法。方法采用的色谱柱为依立特C18柱(4.6mm×100mm,5μm),流速0.8ml/min,紫外检测波长254nm,柱温40℃。咪达唑仑(midazo-lam,MDZ)与大鼠肝微粒体温孵后,加入甲醇在低温下终止反应,再加入定量内标地西泮(diazepam,DZP),涡旋后高速离心,取上清液50μl进样。结果1′-羟基咪达唑仑(1-hydroxymidazolam,1′-OHMDZ)与内标DZPtR分别为7.02min、10.51min,峰形对称且分离充分(R>1.5),线性范围为15.6~780ng.ml-1,最低定量限(lower li mit of quantitation,LLOQ)为15.6ng.ml-1,高中低浓度提取回收率为106.3%、102.5%和102.6%,待测物的日内、日间相对标准偏差(rela-tive standard deviation,RSD)小于10%。肝微粒体Km=15μmol.L-1,Vmax=0.08159nM.min-1.mg-1。结论温孵体系中的其他内源性物质不干扰测定。该方法快速、稳定、灵敏度高,适合体外DZP及其代谢产物1′-羟基咪达唑仑的测定,可用于体外CYP3A酶活性测定或酶动力学研究。