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摘要：通过规模测序和生物信息学分析，从花生荚果不同发育时期全长cDNA文库中筛选出MADS-box家族的一个cDNA全长序列，命名为CEM1基因（GenBank登录号为EY396043）。该基因全长1 061 bp，包含762 bp的开放阅读框，编码253个氨基酸，蛋白质的分子量为29405 ku，等电点（pI）为918。蛋白质信号肽分析和疏水性分析表明，该基因编码的蛋白质信号肽剪切的可能性很小，具有亲水性。同时构建CEM1基因的VIGS表达载体，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
关键词：花生；荚果发育；CEM1基因；生物信息学；载体构建
中图分类号：Q785：S565.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）08-0009-06
MADS-box的名称来自酿酒酵母转录因子MCM1、拟南芥花同源异型基因蛋白AGAMOUS、金鱼草花同源异型基因蛋白DEFICIENS和人血清应答因子SRF 4种蛋白的首字母，这4种蛋白质都有一个由56～58个氨基酸组成的高度保守的MADS盒，编码含有这种保守序列蛋白因子的基因称为MADS-box基因。病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可以引起内源mRNA序列特异性降解[1，2]，即如果在病毒载体中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物会表现出目的基因功能丧失或者表达水平下降的表型，从而确定基因功能。其作用机制为：含有目的基因片段的病毒载体在被侵染的植物组织中大量复制，病毒载体中的目的片段在RNA引导的RNA聚合酶作用下合成大量的双链RNA（Double-stranded RNA， dsRNA）；dsRNA在Dicer酶的作用下产生21～25个核苷酸的短干扰RNA（Small interfering RNA， siRNA）；然后，siRNA的反义链和RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）结合，特异性识别细胞质中目的基因的单链mRNA，造成目的基因mRNA的特异性降解，从而导致目的基因在RNA水平上的沉默[3～5]。本试验克隆了花生MADS-box基因，对其及编码的蛋白进行生物信息学分析，并构建了VIGS表达载体，为转基因奠定基础，这对花生分子育种实践以及阐明果实与种子发育相关的遗传和生理现象具有重要意义。
1材料与方法11试验材料
1.1.1植物材料本研究所用材料为花生品种闽花6号。
1.1.2试剂与仪器本研究所用逆转录酶、DNA酶、Ex Taq酶 、RNA酶抑制剂、内切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等购自大连宝生物公司；DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其它化学试剂为国产分析纯。
Biometra PCR仪购自华粤行仪器有限公司；UV-2800/2802/2802S型紫外可见分光光度计购自尤尼柯（上海）仪器有限公司；UV-2000系列紫外分析仪购自天能科技（上海）有限公司。
2结果与分析
2.1花生CEM1基因的克隆
通过全长cDNA文库筛选和EST测序得到了该基因的EST序列，其克隆号为2P7，命名为CEM1， GenBank登录号为EY396043。双向测序结果表明CEM1全长1 061 bp，包含一个762 bp的ORF，编码253个氨基酸（图1），相对分子量为29405 ku，理论等电点（pI）为918。将该基因序列在NCBI中进行Blast比较，结果与豌豆已知基因（GenBank 登陆号为AAX69070）的同源性为79%；将推导的氨基酸序列在蛋白数据库里进行Blast分析，结果与一个花生MADS-box基因氨基酸序列同源性为84%，由此确认CEM1是花生MADS-box基因。
2.2CEM1蛋白序列分析
将推导的CEM1氨基酸序列与其它10个物种来源的MADS-box氨基酸序列进行比对并构建系统进化树。序列比对结果显示CEM1与大豆的AGL1（GI：358248235）序列比较一致，与苜蓿等其它来源的氨基酸序列也存在一定的同源性（图2）。系统进化树结果显示CEM1与大豆AGL1亲缘关系较近（图3）。
2.3CEM1蛋白的结构域、信号肽与疏水性分析
将推导的CEM1氨基酸序列进行保守区域分析，发现该序列有两个保守结构域：MADS_MEF2_like功能域和K-box结构域（图4）。具有MADS-box蛋白的典型结构。
3讨论
MADS-box是一类数量庞大的基因家族，其编码的蛋白是一类转录因子，具有高度保守的MADS-box 结构域和半保守的能形成卷曲螺旋的K区[6]。MADS-box基因又分为3个主要类群，即ARG80基因家族、MEF2基因家族以及MIKC基因家族[7]。植物基因组含有大量的MADS-box基因，它在植物的发育过程尤其是生殖发育过程中起着广泛的调节作用[8]，其主要功能是调控植物花的发育和果实的成熟。但也有研究显示MADS-box调控着其它器官的发育，如Buchner等发现一个MADS-box基因在豌豆种皮中表达[9]。关于花生MADS-box基因及其对胚胎和种子发育过程调节作用的研究还未见报道。本研究克隆得到花生CEM1基因，经生物信息学分析，确认为花生MADS-box家族的一员，并构建了VIGS表达载体，对于利用遗传操作技术如转基因等培育优良的作物品种[10，11，12]、解释植物生长发育理论和阐明相关的遗传和生理现象等具有重要意义。 参考文献：
[1]王宏芝， 李瑞芬， 王国英， 等 病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组学研究中的应用[J] 自然科学进展， 2005， 15（1）： 8-14
[2]Bartel D P MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function [J] Cell， 2004， 116（2）： 281-297
[3]Burch-Smith T M， Anderson J C， Martin G B， et al Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants [J] The Plant Journal， 2004， 39（5）： 734-746
[4]Kjemtrup S， Sampson K S， Peele C G， et al Gene silencing from plant DNA carried by a Geminivirus[J] The Plant Journal， 1998，14（1）：91-100
[5]Martinez J， Patkaniowska A， Urlaub H， et al Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi[J] Cell， 2002， 110（5）： 563-574
[6]Ma H， Yanofsky M F， Meyerowitz E M AGL1-AGL6， an Arabidopsis gene family with similarity to floral homeotic and transcription factor genes [J] Genes Dev， 1991， 5（3）： 48-49
[7]Theissen G， Saedler H MADS-box genes in plant ontogeny and phylogeny： Haeckel’s ‘biogenetic law’ revisited [J] Curr OpinGenetDev，1995，5（5）：628-639
[8]Lucie P， Stefan F， Martin K， et al. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-Box transcription factor family in Arabidopsis New Openings to the MADS World [J] Plant Cell， 2003， 15（7）：538-1551
[9]Buchner P， Boutin J P A MADS box transcription factor of the AP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea （Pisum sativum） during development [J] Plant Mol Biol， 1998， 38（6）：1253-1255
[10]张则婷， 李学宝 MADS-box基因在植物发育中的功能[J] 植物生理学通讯， 2007， 43（2）： 218-222
[11]李莉， 侯丽霞， 施木田， 等 番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建[J] 山东农业科学， 2009，1：1-3
[12]马乐园， 于喜艳 甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建[J] 山东农业科学， 2011，8：4-7
关键词：花生；荚果发育；CEM1基因；生物信息学；载体构建
中图分类号：Q785：S565.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）08-0009-06
MADS-box的名称来自酿酒酵母转录因子MCM1、拟南芥花同源异型基因蛋白AGAMOUS、金鱼草花同源异型基因蛋白DEFICIENS和人血清应答因子SRF 4种蛋白的首字母，这4种蛋白质都有一个由56～58个氨基酸组成的高度保守的MADS盒，编码含有这种保守序列蛋白因子的基因称为MADS-box基因。病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可以引起内源mRNA序列特异性降解[1，2]，即如果在病毒载体中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物会表现出目的基因功能丧失或者表达水平下降的表型，从而确定基因功能。其作用机制为：含有目的基因片段的病毒载体在被侵染的植物组织中大量复制，病毒载体中的目的片段在RNA引导的RNA聚合酶作用下合成大量的双链RNA（Double-stranded RNA， dsRNA）；dsRNA在Dicer酶的作用下产生21～25个核苷酸的短干扰RNA（Small interfering RNA， siRNA）；然后，siRNA的反义链和RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）结合，特异性识别细胞质中目的基因的单链mRNA，造成目的基因mRNA的特异性降解，从而导致目的基因在RNA水平上的沉默[3～5]。本试验克隆了花生MADS-box基因，对其及编码的蛋白进行生物信息学分析，并构建了VIGS表达载体，为转基因奠定基础，这对花生分子育种实践以及阐明果实与种子发育相关的遗传和生理现象具有重要意义。
1材料与方法11试验材料
1.1.1植物材料本研究所用材料为花生品种闽花6号。
1.1.2试剂与仪器本研究所用逆转录酶、DNA酶、Ex Taq酶 、RNA酶抑制剂、内切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等购自大连宝生物公司；DNA胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其它化学试剂为国产分析纯。
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2结果与分析
2.1花生CEM1基因的克隆
通过全长cDNA文库筛选和EST测序得到了该基因的EST序列，其克隆号为2P7，命名为CEM1， GenBank登录号为EY396043。双向测序结果表明CEM1全长1 061 bp，包含一个762 bp的ORF，编码253个氨基酸（图1），相对分子量为29405 ku，理论等电点（pI）为918。将该基因序列在NCBI中进行Blast比较，结果与豌豆已知基因（GenBank 登陆号为AAX69070）的同源性为79%；将推导的氨基酸序列在蛋白数据库里进行Blast分析，结果与一个花生MADS-box基因氨基酸序列同源性为84%，由此确认CEM1是花生MADS-box基因。
2.2CEM1蛋白序列分析
将推导的CEM1氨基酸序列与其它10个物种来源的MADS-box氨基酸序列进行比对并构建系统进化树。序列比对结果显示CEM1与大豆的AGL1（GI：358248235）序列比较一致，与苜蓿等其它来源的氨基酸序列也存在一定的同源性（图2）。系统进化树结果显示CEM1与大豆AGL1亲缘关系较近（图3）。
2.3CEM1蛋白的结构域、信号肽与疏水性分析
将推导的CEM1氨基酸序列进行保守区域分析，发现该序列有两个保守结构域：MADS_MEF2_like功能域和K-box结构域（图4）。具有MADS-box蛋白的典型结构。
3讨论
MADS-box是一类数量庞大的基因家族，其编码的蛋白是一类转录因子，具有高度保守的MADS-box 结构域和半保守的能形成卷曲螺旋的K区[6]。MADS-box基因又分为3个主要类群，即ARG80基因家族、MEF2基因家族以及MIKC基因家族[7]。植物基因组含有大量的MADS-box基因，它在植物的发育过程尤其是生殖发育过程中起着广泛的调节作用[8]，其主要功能是调控植物花的发育和果实的成熟。但也有研究显示MADS-box调控着其它器官的发育，如Buchner等发现一个MADS-box基因在豌豆种皮中表达[9]。关于花生MADS-box基因及其对胚胎和种子发育过程调节作用的研究还未见报道。本研究克隆得到花生CEM1基因，经生物信息学分析，确认为花生MADS-box家族的一员，并构建了VIGS表达载体，对于利用遗传操作技术如转基因等培育优良的作物品种[10，11，12]、解释植物生长发育理论和阐明相关的遗传和生理现象等具有重要意义。 参考文献：
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[4]Kjemtrup S， Sampson K S， Peele C G， et al Gene silencing from plant DNA carried by a Geminivirus[J] The Plant Journal， 1998，14（1）：91-100
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[9]Buchner P， Boutin J P A MADS box transcription factor of the AP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea （Pisum sativum） during development [J] Plant Mol Biol， 1998， 38（6）：1253-1255
[10]张则婷， 李学宝 MADS-box基因在植物发育中的功能[J] 植物生理学通讯， 2007， 43（2）： 218-222
[11]李莉， 侯丽霞， 施木田， 等 番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建[J] 山东农业科学， 2009，1：1-3
[12]马乐园， 于喜艳 甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建[J] 山东农业科学， 2011，8：4-7