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摘要：【目的】克隆猪EIF2S3基因mRNA全长，并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征，为研究真核翻译起始因子2（eIF2）蛋白γ亚基的生物学功能打下基础。【方法】以荣昌猪胸腺mRNA为模板，采用RCAE-PCR克隆EIF2S3基因的mRNA全长序列，在线完成各种生物信息学分析后，利用实时荧光定量PCR分析猪EIF2S3基因的组织表达特征。【结果】猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp，其中蛋白质编码区（CDS）长1419 bp，5' UTR区、3' UTR区分别长14和380 bp，编码472个氨基酸。EIF2S3蛋白分子量51.1 kD，理论等电点（pI）8.62，包含58个带正电的氨基酸和52个带负电的氨基酸，其前体蛋白靠近N端区域有一个强疏水区；EIF2S3蛋白的空间结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成。EIF2S3蛋白氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高（99.6%），其次是马、猫、牛、羊和人类（99.4%），与斑马鱼的相似性最低（96.6%）。EIF2S3基因在猪的心脏、胸腺和淋巴组织中表达量较高，在脾脏和肌肉中呈中度表达，在肾脏中的表达量较低，而在肝脏中基本不表达。【结论】猪EIF2S3基因全长1813 bp，在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源，尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近；其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高，在肝脏中基本不表达，据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能，基本不发挥能量代谢功能。
关键词： 猪；真核翻译起始因子2（eIF2）；EIF2S3基因；克隆；序列分析；组织表达谱
中图分类号： S828.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2062-08
0 引言
【研究意义】动物机体可通过调节蛋白合成来调控基因的快速、可逆及空间表达，其中翻译起始既是蛋白合成的第一步，也是限制蛋白合成的关键步骤（Jackson et al.，2010）。真核翻译起始因子2（Eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）可与GTP和tRNAiMet相互结合形成三元复合物，而三元复合物先与核糖体40S结合形成翻译起始前复合物，再与mRNA的5'末端结合并搜寻mRNA的翻译起始位点（通常为AUG密码子）（Yatime et al.，2007），继而启动后续的翻译过程。因此，研究eIF2的生物学功能对揭示真核生物蛋白合成机理具有重要意义。【前人研究进展】eIF2由3个高度保守的亚基（α、β和γ）序列组成。其中，α亚基是eIF2的调节亚基，即eIF2上游的各磷酸化激酶通过α亚基上的第51位丝氨酸磷酸化位点调节eIF2蛋白活性；β亚基的主要功能是与eIF2下游蛋白eIF5和eIF2B及RNA结合，启动蛋白合成（Kimball and Jefferson，2004）；γ亚基是eIF2的核心亚基（Yatime et al.，2007），具有结合GTP及tRNA的能力，还能结合Zn2+的锌指结合基序（Ito et al.，2004；Rollmecak et al.，2004；Hinnebusch，2005）。eIF2蛋白γ亚基含有472个氨基酸，由EIF2S3基因编码，其分子量约51.0 kD。已有研究表明，EIF2S3基因变异及其表达量变化与多种疾病相关。如EIF2S3蛋白第465位亮氨酸向絲氨酸的移码突变及第108位丝氨酸向精氨酸的错义突变，会引起临床表现为精神发育迟滞、癫痫、性腺机能减退/先天性不育、小头和肥胖的MEHMO症（Moortgat et al.，2016；Michaud，2017；Skopkova et al.，2017；Stanik et al.，2018）；EIF2S3基因可能是通过N-myc下游的调节基因1间接抑制前列腺癌转移（Tu et al.，2007）；EIF2S3基因下调表达与结直肠癌（Quyun et al.，2010；Chang et al.，2014a，2014b）及非小细胞肺癌（Chian et al.，2016）显著相关。此外，EIF2S3可能通过影响eIF2的整体功能而影响动物机体的其他性状。Li等（2015）研究表明，EIF2S3基因是与鸡胸肌初始pH相关的一个候选基因。可见，EIF2S3基因在生物体内发挥着多种重要功能，如调控机体免疫及肌肉品质相关功能。【本研究切入点】目前，有关EIF2S3基因的研究主要集中在人类疾病方面，而在家畜、家禽等物种中的研究鲜见报道，对该基因的其他生物学功能也缺乏进一步探究。【拟解决的关键问题】以荣昌猪胸腺mRNA为模版，利用3'-RACE、5'-RACE和RT-PCR克隆猪EIF2S3基因mRNA，并对EIF2S3基因mRNA全长序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR分析EIF2S3基因的组织表达特征，以期为进一步研究猪eIF2蛋白γ亚基的生物学功能打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试猪品种为荣昌猪，由重庆市畜牧科学院荣昌猪国家资源保种场提供。mRNA提取、cDNA合成与反转录等试剂盒购自美国Clontech公司，DNA回收和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，pMD19-T载体及其他相关试剂均购自TaKaRa公司。
1. 2 组织RNA提取及cDNA合成
利用RNeasy? Mini Kit提取猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、胸腺及淋巴组织总RNA，并以Nanodrop 2000测定RNA浓度及其OD，RNA完整性采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。cDNA合成则参照试剂盒说明进行操作，总RNA用量均为1 μg。
1. 3 引物设计与合成
引物设计所需序列从NCBI数据库下载（NC_010461.5），采用Primer Premier 3.0进行设计，所有引物（表1）由苏州金唯智生物科技有限公司合成。 1. 4 猪EIF2S3基因克隆及5'-RACE和3'-RACE
猪EIF2S3基因保守片段扩增及5'-RACE和3'-RACE的反应体系、扩增程序均采用本课题组成熟的研究方法（龙熙等，2017）。
1. 5 序列生物信息学分析
在线完成测序结果验证、放阅读框查找和翻译、蛋白理化性质分析、蛋白亲/疏水性、蛋白二级结构预测、蛋白三级结构建模、氨基酸序列多重比对及物种发育进化树等生物信息学分析，具体方法参照笔者先前发表的文章（龙熙等，2017）。
1. 6 实时荧光定量PCR
在ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System上以GoTaq? qPCR Master Mix检测猪EIF2S3基因mRNA在各组织中的表达情况，选用5头猪作为生物学重复。反应体系及扩增程序也参照笔者先前发表的文章（龙熙等，2017），最后采用2-ΔΔCt法计算EIF2S3基因在各组织中的相对表达量。
1. 7 统计分析
采用Excel 2010统计整理试验数据，再以SPSS 19.0中的t 检验进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 猪EIF2S3基因mRNA全长克隆及序列分析结果
RACE-PCR扩增获得的3种长度扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1所示。各目的片段扩增产物经凝胶回收、T克隆、测序及拼接后即得到EIF2S3基因mRNA全长，然后在NCBI数据库中进行同源性比对分析，结果表明，扩增得到的EIF2S3基因mRNA全长序列属于eIF2 γ亚基的编码基因，全长1813 bp，其中蛋白质编码区（CDS）长1419 bp，编码472个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，5' UTR区和3' UTR区分别为14和380 bp（图2）。
2. 2 猪EIF2S3蛋白理化性质及其结构分析结果
猪EIF2S3蛋白的分子式为C2272H3732N628O666S19，分子量51.1 kD，理论等电点（pI）8.62；包含20种基本氨基酸（图3），以亮氨酸的含量最高（17.8%），并有52个带负电的氨基酸残基（23个天冬氨酸，29个谷氨酸）和58个带正电的氨基酸残基（22个精氨酸，36个赖氨酸）。
猪EIF2S3蛋白亲/疏水性预测分析结果表明，在EIF2S3前体蛋白靠近N端的第149～160位氨基酸形成一个强的疏水区，其中第159位异亮氨酸的疏水性最强（分值为4.5），其次是第156～158位的亮氨酸（分值为3.8）（图4）；在整个成熟多肽链中亲水性氨基酸和疏水性氨基酸均有分布。
猪EIF2S3蛋白二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲4种结构构成（图5），各种结构所占比例分别为31.36%、10.17%、25.85%和32.63%。其中，α-螺旋主要分布在多肽链的中部及靠近C端的区域，β-折叠、延伸及无规则卷曲则相对均匀地分布在整条多肽链中。三级结构预测分析结果也表明，猪EIF2S3蛋白由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲4种结构构成（图6），与其二级结构预测结果一致。
2. 3 猪EIF2S3蛋白同源性及其遗传进化分析结果
猪EIF2S3基因CDS区核酸序列及其推导氨基酸序列与各参照物种的相似性均较高（表2），其中，猪EIF2S3基因CDS区核酸序列与狗的相似性最高（93.7%），其次是马（93.1%），与斑马鱼的相似性最低（80.1%）；其推导氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高（99.6%），其次是马、猫、牛、羊和人类（99.4%），与斑马鱼的相似性最低（96.6%）（图7）。从基于EIF2S3基因构建的物种发育进化树（图8）也可看出，猪EIF2S3基因能与其他物种的EIF2S3基因聚类到一起，表明猪EIF2S3与这些物种的EIF2S3属于同一类群。
2. 4 猪EIF2S3基因的组织表达特征
猪EIF2S3基因在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的相对表达量较高，显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）；猪EIF2S3基因在其肾脏中的相对表达量较低，而在肝脏中基本不表达（图9）。
3 讨论
eIF2是一个真核翻译起始因子，为大多数真核蛋白翻译起始所必需，通过GTP依赖性方式介导tRNAMet与核糖体结合，而在mRNA翻译成蛋白的过程中发挥重要作用（Kimball，1999）。eIF2由α、β和γ 3个亚基构成，γ亚基是eIF2的核心亚基（Yatime et al.，2007），其主要功能是结合GTP及tRNAMet并将tRNAMet转运到核糖体40S上，以启动真核蛋白翻译（Kimball，1999）。因此，γ亚基直接决定着eIF2是否能正常启动蛋白翻译。eIF2的γ亚基由EIF2S3基因编码，而与EIF2S3相关的疾病有MEHMO症（Moortgat et al.，2016；Michaud，2017；Skopkova et al.，2017；Stanik et al.，2018）、前列腺癌（Tu et al.，2007）、结直肠癌（Chang et al.，2014a，2014b）及非小细胞肺癌（Chian et al.，2016）。至今，针对EIF2S3的研究主要集中在人类疾病上，有关畜禽等物种的研究鲜见报道，仅有一篇研究文献通过基因定位发现EIF2S3基因与鸡的胸肌初始pH有关（Li et al.，2015）。为此，本研究以荣昌猪胸腺mRNA为模版，克隆EIF2S3基因mRNA全长，并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征，以期为研究EIF2S3基因生物学功能打下基础。
本研究克隆获得的猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp，其中，CDS区长1419 bp，5' UTR区长14 bp，3' UTR区长380 bp。与NCBI数据库中已有的杜洛克猪EIF2S3基因预测转录本序列（XM_021080522.1、XM_003134980.6）相比，本研究仅从荣昌猪胸腺组织中克隆获得1个转录本，且5' UTR区和3' UTR与NCBI数据库中的预测转录本不完全相同（朱江江等，2017），因此，荣昌猪中是否还存在其他转录本尚需进一步研究验证。本研究克隆获得的猪EIF2S3基因CDS区长度与2个预测转录本相同，但5' UTR区较2个预测转录本分别短153和154 bp，3' UTR区较2个预测转录本分别短539和467 bp，说明EIF2S3在不同猪品种中可能具有不同的剪切模式。在EIF2S3前体蛋白的近N端有一个强疏水区，推测这种疏水性的氨基酸组成可能更有利于与内质网脂膜结合，继而进入内质网发挥其翻译起始的功能（Rapoport，2017）。α-螺旋主要分布在多肽鏈的中部及靠近C端的区域，通常α-螺旋有利于蛋白跨膜（Blom et al.，2004；田巧珍等，2017），因此，EIF2S3蛋白中部及靠近C端的区域可能更有利于eIF2进入内质网发挥功能；β-折叠则相对均匀地分布在整条多肽链上，有助于分子间紧密结合以形成相对稳定的化学结构，从而使EIF2S3能在复杂的细胞内环境中仍保持原有的生物活性，以便更好地发挥其功能作用（Lehrer，2004；田巧珍等，2017）。 本研究的蛋白氨基酸序列多重比对分析结果表明，猪EIF2S3蛋白与各物种的相似性极高（96.6%～99.6%），说明EIF2S3是一个在各物种中均高度保守的蛋白。从基于EIF2S3基因构建的物种发育进化树也发现，猪EIF2S3基因能与其他物种聚类到一起，说明这些物种的EIF2S3基因极有可能是由共同的祖先进化而来。猪EIF2S3基因组织表达谱显示，EIF2S3基因在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高，在脾脏和肌肉中呈中度表达，在肾脏中的表达量较低，而在肝脏中基本不表达。说明EIF2S3蛋白参与构成的eIF2可能更多地参与心脏、胸腺和淋巴组织中的蛋白合成，在肾脏和肝脏中则参与较少或基本不参与。据此推测，EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能，基本不发挥能量代谢功能。猪与人类在基因组序列、染色体结构、解剖学及生理学方面具有很高的相似性（Vamathevan et al.，2013；李盈辉等，2016；许崇利等，2017），因此，猪是较斑马鱼和小鼠更具优势的人类疾病研究模式动物。但根据NCBI数据库提供的信息，EIF2S3基因在人类心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌和淋巴组织中的表达量均较高，而在胸腺组织中不表达，与本研究中EIF2S3基因在猪各组织中的表达情况存在差异。这也提示，在选择猪作为人类疾病研究模型时可能需要有所侧重，不能一概而论。
4 结论
猪EIF2S3基因全长1813 bp，在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源，尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近；其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高，在肝脏中基本不表达，据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能，基本不发挥能量代谢功能。
参考文献：
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 猪；真核翻译起始因子2（eIF2）；EIF2S3基因；克隆；序列分析；组织表达谱
中图分类号： S828.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2062-08
0 引言
【研究意义】动物机体可通过调节蛋白合成来调控基因的快速、可逆及空间表达，其中翻译起始既是蛋白合成的第一步，也是限制蛋白合成的关键步骤（Jackson et al.，2010）。真核翻译起始因子2（Eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）可与GTP和tRNAiMet相互结合形成三元复合物，而三元复合物先与核糖体40S结合形成翻译起始前复合物，再与mRNA的5'末端结合并搜寻mRNA的翻译起始位点（通常为AUG密码子）（Yatime et al.，2007），继而启动后续的翻译过程。因此，研究eIF2的生物学功能对揭示真核生物蛋白合成机理具有重要意义。【前人研究进展】eIF2由3个高度保守的亚基（α、β和γ）序列组成。其中，α亚基是eIF2的调节亚基，即eIF2上游的各磷酸化激酶通过α亚基上的第51位丝氨酸磷酸化位点调节eIF2蛋白活性；β亚基的主要功能是与eIF2下游蛋白eIF5和eIF2B及RNA结合，启动蛋白合成（Kimball and Jefferson，2004）；γ亚基是eIF2的核心亚基（Yatime et al.，2007），具有结合GTP及tRNA的能力，还能结合Zn2+的锌指结合基序（Ito et al.，2004；Rollmecak et al.，2004；Hinnebusch，2005）。eIF2蛋白γ亚基含有472个氨基酸，由EIF2S3基因编码，其分子量约51.0 kD。已有研究表明，EIF2S3基因变异及其表达量变化与多种疾病相关。如EIF2S3蛋白第465位亮氨酸向絲氨酸的移码突变及第108位丝氨酸向精氨酸的错义突变，会引起临床表现为精神发育迟滞、癫痫、性腺机能减退/先天性不育、小头和肥胖的MEHMO症（Moortgat et al.，2016；Michaud，2017；Skopkova et al.，2017；Stanik et al.，2018）；EIF2S3基因可能是通过N-myc下游的调节基因1间接抑制前列腺癌转移（Tu et al.，2007）；EIF2S3基因下调表达与结直肠癌（Quyun et al.，2010；Chang et al.，2014a，2014b）及非小细胞肺癌（Chian et al.，2016）显著相关。此外，EIF2S3可能通过影响eIF2的整体功能而影响动物机体的其他性状。Li等（2015）研究表明，EIF2S3基因是与鸡胸肌初始pH相关的一个候选基因。可见，EIF2S3基因在生物体内发挥着多种重要功能，如调控机体免疫及肌肉品质相关功能。【本研究切入点】目前，有关EIF2S3基因的研究主要集中在人类疾病方面，而在家畜、家禽等物种中的研究鲜见报道，对该基因的其他生物学功能也缺乏进一步探究。【拟解决的关键问题】以荣昌猪胸腺mRNA为模版，利用3'-RACE、5'-RACE和RT-PCR克隆猪EIF2S3基因mRNA，并对EIF2S3基因mRNA全长序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR分析EIF2S3基因的组织表达特征，以期为进一步研究猪eIF2蛋白γ亚基的生物学功能打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试猪品种为荣昌猪，由重庆市畜牧科学院荣昌猪国家资源保种场提供。mRNA提取、cDNA合成与反转录等试剂盒购自美国Clontech公司，DNA回收和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，pMD19-T载体及其他相关试剂均购自TaKaRa公司。
1. 2 组织RNA提取及cDNA合成
利用RNeasy? Mini Kit提取猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、胸腺及淋巴组织总RNA，并以Nanodrop 2000测定RNA浓度及其OD，RNA完整性采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。cDNA合成则参照试剂盒说明进行操作，总RNA用量均为1 μg。
1. 3 引物设计与合成
引物设计所需序列从NCBI数据库下载（NC_010461.5），采用Primer Premier 3.0进行设计，所有引物（表1）由苏州金唯智生物科技有限公司合成。 1. 4 猪EIF2S3基因克隆及5'-RACE和3'-RACE
猪EIF2S3基因保守片段扩增及5'-RACE和3'-RACE的反应体系、扩增程序均采用本课题组成熟的研究方法（龙熙等，2017）。
1. 5 序列生物信息学分析
在线完成测序结果验证、放阅读框查找和翻译、蛋白理化性质分析、蛋白亲/疏水性、蛋白二级结构预测、蛋白三级结构建模、氨基酸序列多重比对及物种发育进化树等生物信息学分析，具体方法参照笔者先前发表的文章（龙熙等，2017）。
1. 6 实时荧光定量PCR
在ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System上以GoTaq? qPCR Master Mix检测猪EIF2S3基因mRNA在各组织中的表达情况，选用5头猪作为生物学重复。反应体系及扩增程序也参照笔者先前发表的文章（龙熙等，2017），最后采用2-ΔΔCt法计算EIF2S3基因在各组织中的相对表达量。
1. 7 统计分析
采用Excel 2010统计整理试验数据，再以SPSS 19.0中的t 检验进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 猪EIF2S3基因mRNA全长克隆及序列分析结果
RACE-PCR扩增获得的3种长度扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1所示。各目的片段扩增产物经凝胶回收、T克隆、测序及拼接后即得到EIF2S3基因mRNA全长，然后在NCBI数据库中进行同源性比对分析，结果表明，扩增得到的EIF2S3基因mRNA全长序列属于eIF2 γ亚基的编码基因，全长1813 bp，其中蛋白质编码区（CDS）长1419 bp，编码472个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，5' UTR区和3' UTR区分别为14和380 bp（图2）。
2. 2 猪EIF2S3蛋白理化性质及其结构分析结果
猪EIF2S3蛋白的分子式为C2272H3732N628O666S19，分子量51.1 kD，理论等电点（pI）8.62；包含20种基本氨基酸（图3），以亮氨酸的含量最高（17.8%），并有52个带负电的氨基酸残基（23个天冬氨酸，29个谷氨酸）和58个带正电的氨基酸残基（22个精氨酸，36个赖氨酸）。
猪EIF2S3蛋白亲/疏水性预测分析结果表明，在EIF2S3前体蛋白靠近N端的第149～160位氨基酸形成一个强的疏水区，其中第159位异亮氨酸的疏水性最强（分值为4.5），其次是第156～158位的亮氨酸（分值为3.8）（图4）；在整个成熟多肽链中亲水性氨基酸和疏水性氨基酸均有分布。
猪EIF2S3蛋白二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲4种结构构成（图5），各种结构所占比例分别为31.36%、10.17%、25.85%和32.63%。其中，α-螺旋主要分布在多肽链的中部及靠近C端的区域，β-折叠、延伸及无规则卷曲则相对均匀地分布在整条多肽链中。三级结构预测分析结果也表明，猪EIF2S3蛋白由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲4种结构构成（图6），与其二级结构预测结果一致。
2. 3 猪EIF2S3蛋白同源性及其遗传进化分析结果
猪EIF2S3基因CDS区核酸序列及其推导氨基酸序列与各参照物种的相似性均较高（表2），其中，猪EIF2S3基因CDS区核酸序列与狗的相似性最高（93.7%），其次是马（93.1%），与斑马鱼的相似性最低（80.1%）；其推导氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高（99.6%），其次是马、猫、牛、羊和人类（99.4%），与斑马鱼的相似性最低（96.6%）（图7）。从基于EIF2S3基因构建的物种发育进化树（图8）也可看出，猪EIF2S3基因能与其他物种的EIF2S3基因聚类到一起，表明猪EIF2S3与这些物种的EIF2S3属于同一类群。
2. 4 猪EIF2S3基因的组织表达特征
猪EIF2S3基因在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的相对表达量较高，显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）；猪EIF2S3基因在其肾脏中的相对表达量较低，而在肝脏中基本不表达（图9）。
3 讨论
eIF2是一个真核翻译起始因子，为大多数真核蛋白翻译起始所必需，通过GTP依赖性方式介导tRNAMet与核糖体结合，而在mRNA翻译成蛋白的过程中发挥重要作用（Kimball，1999）。eIF2由α、β和γ 3个亚基构成，γ亚基是eIF2的核心亚基（Yatime et al.，2007），其主要功能是结合GTP及tRNAMet并将tRNAMet转运到核糖体40S上，以启动真核蛋白翻译（Kimball，1999）。因此，γ亚基直接决定着eIF2是否能正常启动蛋白翻译。eIF2的γ亚基由EIF2S3基因编码，而与EIF2S3相关的疾病有MEHMO症（Moortgat et al.，2016；Michaud，2017；Skopkova et al.，2017；Stanik et al.，2018）、前列腺癌（Tu et al.，2007）、结直肠癌（Chang et al.，2014a，2014b）及非小细胞肺癌（Chian et al.，2016）。至今，针对EIF2S3的研究主要集中在人类疾病上，有关畜禽等物种的研究鲜见报道，仅有一篇研究文献通过基因定位发现EIF2S3基因与鸡的胸肌初始pH有关（Li et al.，2015）。为此，本研究以荣昌猪胸腺mRNA为模版，克隆EIF2S3基因mRNA全长，并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征，以期为研究EIF2S3基因生物学功能打下基础。
本研究克隆获得的猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp，其中，CDS区长1419 bp，5' UTR区长14 bp，3' UTR区长380 bp。与NCBI数据库中已有的杜洛克猪EIF2S3基因预测转录本序列（XM_021080522.1、XM_003134980.6）相比，本研究仅从荣昌猪胸腺组织中克隆获得1个转录本，且5' UTR区和3' UTR与NCBI数据库中的预测转录本不完全相同（朱江江等，2017），因此，荣昌猪中是否还存在其他转录本尚需进一步研究验证。本研究克隆获得的猪EIF2S3基因CDS区长度与2个预测转录本相同，但5' UTR区较2个预测转录本分别短153和154 bp，3' UTR区较2个预测转录本分别短539和467 bp，说明EIF2S3在不同猪品种中可能具有不同的剪切模式。在EIF2S3前体蛋白的近N端有一个强疏水区，推测这种疏水性的氨基酸组成可能更有利于与内质网脂膜结合，继而进入内质网发挥其翻译起始的功能（Rapoport，2017）。α-螺旋主要分布在多肽鏈的中部及靠近C端的区域，通常α-螺旋有利于蛋白跨膜（Blom et al.，2004；田巧珍等，2017），因此，EIF2S3蛋白中部及靠近C端的区域可能更有利于eIF2进入内质网发挥功能；β-折叠则相对均匀地分布在整条多肽链上，有助于分子间紧密结合以形成相对稳定的化学结构，从而使EIF2S3能在复杂的细胞内环境中仍保持原有的生物活性，以便更好地发挥其功能作用（Lehrer，2004；田巧珍等，2017）。 本研究的蛋白氨基酸序列多重比对分析结果表明，猪EIF2S3蛋白与各物种的相似性极高（96.6%～99.6%），说明EIF2S3是一个在各物种中均高度保守的蛋白。从基于EIF2S3基因构建的物种发育进化树也发现，猪EIF2S3基因能与其他物种聚类到一起，说明这些物种的EIF2S3基因极有可能是由共同的祖先进化而来。猪EIF2S3基因组织表达谱显示，EIF2S3基因在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高，在脾脏和肌肉中呈中度表达，在肾脏中的表达量较低，而在肝脏中基本不表达。说明EIF2S3蛋白参与构成的eIF2可能更多地参与心脏、胸腺和淋巴组织中的蛋白合成，在肾脏和肝脏中则参与较少或基本不参与。据此推测，EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能，基本不发挥能量代谢功能。猪与人类在基因组序列、染色体结构、解剖学及生理学方面具有很高的相似性（Vamathevan et al.，2013；李盈辉等，2016；许崇利等，2017），因此，猪是较斑马鱼和小鼠更具优势的人类疾病研究模式动物。但根据NCBI数据库提供的信息，EIF2S3基因在人类心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌和淋巴组织中的表达量均较高，而在胸腺组织中不表达，与本研究中EIF2S3基因在猪各组织中的表达情况存在差异。这也提示，在选择猪作为人类疾病研究模型时可能需要有所侧重，不能一概而论。
4 结论
猪EIF2S3基因全长1813 bp，在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源，尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近；其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高，在肝脏中基本不表达，据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能，基本不发挥能量代谢功能。
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（責任编辑 兰宗宝）