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摘要對肿瘤发生发展过程中病变特点进行分子水平的分析,需要保证目标细胞的单一性及纯度。最近发展起来的激光显微切割(LMD)技术,可从所需标本不同成分中获取单一种类细胞,成功的解决肿瘤组织中细胞异质性的问题。概述该技术的实用意义、基本方法及其在肿瘤研究中的应用。
关键词激光显微切割;肿瘤;细胞异质性
中图分类号TG485文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)052-0117-01
肿瘤(tumour)的发生发展是一个多环节、多步骤的过程,为了更好的阐明在肿瘤发生和发展不同阶段如原位癌、早期浸润癌及转移癌发生时特定细胞内的分子生物学改变,我们需要获得单一的同类细胞群。在以往对肿瘤的研究中我们大多以整块组织作为研究对象,但在肿瘤组织中不仅含有肿瘤实质成分,还有间质细胞、炎细胞等成分;有些肿瘤组织还具有异质性的特点,即包含了肿瘤进展不同阶段的病变。这些都会造成实验对象纯度不够,从而导致研究结果出现一定的偏差。还有些研究以培养的肿瘤细胞系为实验材料,虽然部分的解决了细胞单一性的问题,但是细胞在培养过程中是否存在某些附加的突变从而影响实验结果也是值得考虑的。因此如何获取纯净的、单一的细胞群成为亟待解决的问题。
显微切割(microdissection)技术是自90年代初出现的一种新兴技术,能够在显微镜下从组织切片上成功地切割下几百个、几十个同类细胞,甚至某个单一细胞。继而人们可以采用各种分子生物学技术如聚合酶链反应(PCR)、比较基因组杂交(CGH)等,对切割下来的细胞进行专门的研究,从而获得人们想要的准确信息。随着实验研究对技术上要求的进一步需要,激光显微切割(laser microdissection,LMD)技术逐渐为大家所熟悉,目前较成熟的显微切割技术包括:手工显微切割、LMD及激光捕获显微切割等几种。其中手工显微切割技术掺杂太多人为因素,切割的精确度很难保持。激光捕获显微切割选择性很高,但其价格不菲,短时间内这种技术很难普及使用。LMD技术消除了以往手工显微切割带来的人为的影响因素,不会产生外源性污染。成功地解决了组织中的细胞异质性问题,因此将显微切割应用于肿瘤研究领域的意义已渐渐引起人们的注意。
1LMD组织切片的制备
1.1组织处理
目前的实验技术,对获得的组织主要的处理方法有甲醛固定制作石蜡切片,或冷冻处理制作冰冻切片。根据文献报道,甲醛固定可能诱导多种化学修饰和核酸与蛋白间的交联,会大大降低所获细胞的纯度。而进行冷冻保存的组织在结构和成分上基本保持完整,进而保证了不同成分的纯度。
1.2切片制作
首先将进行冰冻处理的组织进行梯度解冻到冰冻切片机的温度,即-20℃。冰冻切片的常规包埋剂可从试剂公司购置,但经过试验我们发现用普通胶水代替包埋剂所获得的切片效果相同。常规的石蜡切片厚度大概都在4～10μm,冰冻切片可以稍厚一些,切取后贴附于特制的薄膜载片上。
1.3固定
显微切割主要是通过形态学观察来获取后续实验所需要的组织成分,对标本组织形态的固定要求很高。部分文献支持无水乙醇脱水的固定方法,认为该方法极大程度的保持了组织的形态特征。Goldsworthy等认为应采用70%乙醇固定冰冻切片。
1.4染色
较常规的染色方法仍然是HE染色。但是研究发现过长时间的染色可导致细胞RNA降解,破坏组织成分。有人提出用改良的HE染色法,即只用苏木素进行快速染色,去掉伊红染色步骤。
2LMD的具体操作
研究者在显微镜下寻找需要的细胞后,用紫外激光切割所需组织或细胞边界,贴附与薄膜上的组织即可在重力的作用下落到玻片下的Eppendoff管中,实现真正的无污染切割。
3LMD在肿瘤研究中的应用
3.1肿瘤克隆起源分析
传统人为肿瘤是单克隆起源,要检验其真实性,就必须获得相对单一的肿瘤细胞成分,LMD便成为这些研究可靠的技术支持。美国国立癌症研究机构在1988年倡议建立cDNA文库,囊括细胞中所有正在表达的基因。LMD成为该课题的支撑技术。Kaserer等通过激光微切割技术获取甲状腺上皮细胞构建了甲状腺组织的cDNA文库,并进行了后续的甲状腺癌的基因表达分析。到目前为止,前列腺、乳腺、肺等组织的正常与癌前病变的cDNA文库正在构建及验证中。
3.2蛋白质组学研究
LMD技术与与二维凝胶电泳和生物质谱等技术结合,组成了蛋白质组学技术。该技术对人类基因组在不同病理条件下所表达的蛋白质组进行研究,建立蛋白“指纹”库,对疾病的早期诊断、早期治疗具有深远意义。Lawrie等采用LMD对结肠癌标本进行切割,分离出结肠癌细胞和正常的结肠上皮细胞,通过二维凝胶电泳和质谱技术确定了细胞角蛋白8(cytokeratin 8)等3种在结肠癌中特异改变的蛋白质,可以进一步来确定新的分子标志物或蛋白质靶,对癌症进行早期诊断。
4展望
LMD技术成功解决了组织异质性问题,该技术的发展推动了肿瘤学等多学科的共同发展。总之,显微切割技术是一种可靠的、高效的获取单一组织的技术,该技术与其他实验技术的有机结合将为肿瘤研究创造一个更好的发展平台。
参考文献
[1]郝权,徐勇,李文灵等.激光捕获显微切割技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用[J].中国生物工程杂志,2005,25(3):74-78.
[2]Emmert-Buck MR, Bonner RF, Smith PD, et al. Laser capture microdisse -ction[J].Science,1996;274:998-1001.
[3]Bonner RF, Emmert-buck MR, Cole K, et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science,1997,278:1481-1483.
[4]Suarez-Quian CA, Coldstein SR, Pohida T, et al. Laser capture microdissec -tion of single cells from complex tissues. Biotechniques,1999;26:328-335.
[5]Liotta LA, Buck ME, Weiss R, et al. Isolation of cellular material under microscopic visualization. Int Cl:[6] AO1N 1-02,AO1N 1-00, AO1N-3-00[J].Patent number:5 843 657,1995-10-10.
[6]Noguchi S, Motomura K, Inaji H, et al. Clonal analysis of predominantly intraductal carcinoma and precancerous lesions of the breast by menas of polymerase chain reaction[J].Cancer Res,1994,54:1849-1853.
[7]Deng G,Lu Y,Zlotmikov G,et al.Loss of heterozygosity in nomal tissue adjacent to breast carcinomas.Science,1996.274:2057-2059.
[8]Figliuzzi M,Zappella S,Morigi M,et al.Influence of donor age on bovine pancreatic islet isolation[J].Transplantation,2000,70:1032-1037.
[9]Burgemeister R,Gangnus R,Haar B,et al High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC(laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathol Res Pract,2003,199:431-436.
[10]Goldsworthy SM, Stockton PS,Trempus CS,et al Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue MolCarcinog,1999,25:86-91.
[11]Kaserer K, Knezevic V, Pichlhofer B, et al. Construction of cDNA libraries from microdissected benign and m alignant thyroid tissue[J]. Lab Invest,2002,82:1707-1714.
[12]Lawrie LC, Curran S, McLeod HL, et al. Application of laser capture micro -dissection and proteomics in colon cancer[J].Mol Pathol,2001,54(4):253-258.
关键词激光显微切割;肿瘤;细胞异质性
中图分类号TG485文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)052-0117-01
肿瘤(tumour)的发生发展是一个多环节、多步骤的过程,为了更好的阐明在肿瘤发生和发展不同阶段如原位癌、早期浸润癌及转移癌发生时特定细胞内的分子生物学改变,我们需要获得单一的同类细胞群。在以往对肿瘤的研究中我们大多以整块组织作为研究对象,但在肿瘤组织中不仅含有肿瘤实质成分,还有间质细胞、炎细胞等成分;有些肿瘤组织还具有异质性的特点,即包含了肿瘤进展不同阶段的病变。这些都会造成实验对象纯度不够,从而导致研究结果出现一定的偏差。还有些研究以培养的肿瘤细胞系为实验材料,虽然部分的解决了细胞单一性的问题,但是细胞在培养过程中是否存在某些附加的突变从而影响实验结果也是值得考虑的。因此如何获取纯净的、单一的细胞群成为亟待解决的问题。
显微切割(microdissection)技术是自90年代初出现的一种新兴技术,能够在显微镜下从组织切片上成功地切割下几百个、几十个同类细胞,甚至某个单一细胞。继而人们可以采用各种分子生物学技术如聚合酶链反应(PCR)、比较基因组杂交(CGH)等,对切割下来的细胞进行专门的研究,从而获得人们想要的准确信息。随着实验研究对技术上要求的进一步需要,激光显微切割(laser microdissection,LMD)技术逐渐为大家所熟悉,目前较成熟的显微切割技术包括:手工显微切割、LMD及激光捕获显微切割等几种。其中手工显微切割技术掺杂太多人为因素,切割的精确度很难保持。激光捕获显微切割选择性很高,但其价格不菲,短时间内这种技术很难普及使用。LMD技术消除了以往手工显微切割带来的人为的影响因素,不会产生外源性污染。成功地解决了组织中的细胞异质性问题,因此将显微切割应用于肿瘤研究领域的意义已渐渐引起人们的注意。
1LMD组织切片的制备
1.1组织处理
目前的实验技术,对获得的组织主要的处理方法有甲醛固定制作石蜡切片,或冷冻处理制作冰冻切片。根据文献报道,甲醛固定可能诱导多种化学修饰和核酸与蛋白间的交联,会大大降低所获细胞的纯度。而进行冷冻保存的组织在结构和成分上基本保持完整,进而保证了不同成分的纯度。
1.2切片制作
首先将进行冰冻处理的组织进行梯度解冻到冰冻切片机的温度,即-20℃。冰冻切片的常规包埋剂可从试剂公司购置,但经过试验我们发现用普通胶水代替包埋剂所获得的切片效果相同。常规的石蜡切片厚度大概都在4～10μm,冰冻切片可以稍厚一些,切取后贴附于特制的薄膜载片上。
1.3固定
显微切割主要是通过形态学观察来获取后续实验所需要的组织成分,对标本组织形态的固定要求很高。部分文献支持无水乙醇脱水的固定方法,认为该方法极大程度的保持了组织的形态特征。Goldsworthy等认为应采用70%乙醇固定冰冻切片。
1.4染色
较常规的染色方法仍然是HE染色。但是研究发现过长时间的染色可导致细胞RNA降解,破坏组织成分。有人提出用改良的HE染色法,即只用苏木素进行快速染色,去掉伊红染色步骤。
2LMD的具体操作
研究者在显微镜下寻找需要的细胞后,用紫外激光切割所需组织或细胞边界,贴附与薄膜上的组织即可在重力的作用下落到玻片下的Eppendoff管中,实现真正的无污染切割。
3LMD在肿瘤研究中的应用
3.1肿瘤克隆起源分析
传统人为肿瘤是单克隆起源,要检验其真实性,就必须获得相对单一的肿瘤细胞成分,LMD便成为这些研究可靠的技术支持。美国国立癌症研究机构在1988年倡议建立cDNA文库,囊括细胞中所有正在表达的基因。LMD成为该课题的支撑技术。Kaserer等通过激光微切割技术获取甲状腺上皮细胞构建了甲状腺组织的cDNA文库,并进行了后续的甲状腺癌的基因表达分析。到目前为止,前列腺、乳腺、肺等组织的正常与癌前病变的cDNA文库正在构建及验证中。
3.2蛋白质组学研究
LMD技术与与二维凝胶电泳和生物质谱等技术结合,组成了蛋白质组学技术。该技术对人类基因组在不同病理条件下所表达的蛋白质组进行研究,建立蛋白“指纹”库,对疾病的早期诊断、早期治疗具有深远意义。Lawrie等采用LMD对结肠癌标本进行切割,分离出结肠癌细胞和正常的结肠上皮细胞,通过二维凝胶电泳和质谱技术确定了细胞角蛋白8(cytokeratin 8)等3种在结肠癌中特异改变的蛋白质,可以进一步来确定新的分子标志物或蛋白质靶,对癌症进行早期诊断。
4展望
LMD技术成功解决了组织异质性问题,该技术的发展推动了肿瘤学等多学科的共同发展。总之,显微切割技术是一种可靠的、高效的获取单一组织的技术,该技术与其他实验技术的有机结合将为肿瘤研究创造一个更好的发展平台。
参考文献
[1]郝权,徐勇,李文灵等.激光捕获显微切割技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用[J].中国生物工程杂志,2005,25(3):74-78.
[2]Emmert-Buck MR, Bonner RF, Smith PD, et al. Laser capture microdisse -ction[J].Science,1996;274:998-1001.
[3]Bonner RF, Emmert-buck MR, Cole K, et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science,1997,278:1481-1483.
[4]Suarez-Quian CA, Coldstein SR, Pohida T, et al. Laser capture microdissec -tion of single cells from complex tissues. Biotechniques,1999;26:328-335.
[5]Liotta LA, Buck ME, Weiss R, et al. Isolation of cellular material under microscopic visualization. Int Cl:[6] AO1N 1-02,AO1N 1-00, AO1N-3-00[J].Patent number:5 843 657,1995-10-10.
[6]Noguchi S, Motomura K, Inaji H, et al. Clonal analysis of predominantly intraductal carcinoma and precancerous lesions of the breast by menas of polymerase chain reaction[J].Cancer Res,1994,54:1849-1853.
[7]Deng G,Lu Y,Zlotmikov G,et al.Loss of heterozygosity in nomal tissue adjacent to breast carcinomas.Science,1996.274:2057-2059.
[8]Figliuzzi M,Zappella S,Morigi M,et al.Influence of donor age on bovine pancreatic islet isolation[J].Transplantation,2000,70:1032-1037.
[9]Burgemeister R,Gangnus R,Haar B,et al High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC(laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathol Res Pract,2003,199:431-436.
[10]Goldsworthy SM, Stockton PS,Trempus CS,et al Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue MolCarcinog,1999,25:86-91.
[11]Kaserer K, Knezevic V, Pichlhofer B, et al. Construction of cDNA libraries from microdissected benign and m alignant thyroid tissue[J]. Lab Invest,2002,82:1707-1714.
[12]Lawrie LC, Curran S, McLeod HL, et al. Application of laser capture micro -dissection and proteomics in colon cancer[J].Mol Pathol,2001,54(4):253-258.