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【摘要】 目的 建立WISTA大鼠三聚氰胺泌尿系结石模型，研究结石形成的机理，通过测定模型血清中胱抑素C的含量，探讨三聚氰胺结石对肾小球滤过率的影响来评定大鼠肾功能的变化。 方法60日龄清洁级WISTA大鼠60只，全部为雄性，体质量（230±17）g，随机分为空白对照组10只和给药组50只，给药组给予三聚氰胺1.0g/(kg*d)，连续灌喂，空白对照组给予无菌蒸馏水2ml/(只*天)，采用免疫比浊法测定大鼠血清胱抑素C水平，并与β2-微球蛋白(β-Mg)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)比较分析，采用体视显微镜及肉眼观察大鼠肾脏、输尿管和膀胱形态改变。结果40d膀胱结石出现率96%，肾结石98%，胱抑素C改变较β2-微球蛋白、肌酐、尿素氮更敏感，与对照组比较肾脏肿大，镜下可见明显片状和黄色颗粒沉淀物。结论三聚氰胺连续给药可诱发大鼠产生泌尿系结石，胱抑素C能敏感评估大鼠模型早期肾功能损害。
【关键词】 胱抑素C；三聚氰胺；大鼠尿石模型
自三聚氰胺奶粉事件后，食品中添加三聚氰胺含量超标现象屡现，早期测定其对人体的损害，评估肾功能，针对性的及时干预治疗，利于受损肾功能的逆转及远期预后。
致病因素和疾病的出现困扰着健康的同时也促进疾病动物模型的不断创新发展，为临床治疗提供理论依据，本实验采取连续灌喂三聚氰胺建立大鼠尿石模型，利用生化、病理等检测手段评估肾功能的损害，观察组织器官的病变，结石形成情况等。三聚氰胺诱发尿结石会造成肾功能的损害，反映肾功能的损害最重要的指标是肾小球滤过率（GFR），而评价GFR外源性指标包括菊粉、51Cr -EDTA、inIaCgol及99m Tc-二乙烯三胺戊乙醇等一些放射性核物，但因其价格昂贵，具污染性，费时长，操作繁琐等【1】无法常规临床上应用，GFR内源性指标包括血尿素氮(BUN) 、肌酐(Cr)、肌酐清除率(Crcl)、尿酸（UA）、β2微球蛋白(β2-MG)、视黄醇结合蛋白(RBP)、尿氨基糖苷酶（NAG）等低相对分子蛋白，但其分泌量少、血中水平不稳定，存在易受年龄、性别、饮食，炎症、肿瘤、烧伤、肌肉含量等内外因素的影响，都不是理想的标记物，难以早期评定早期肾功能的损害。所以要求寻求一种标记物应具有：（1）恒定的速率入血.（2）血中浓度稳定，不受自身及外界因素变化影响.（3）肾小球完全滤过；不由肾小管重吸收或分泌；经过肾脏排出。
临床上期待一种新的理想的GFR内生标记物，胱抑素C（Cys-C）是一种小分子蛋白质（13KD），是胱氨酸蛋白酶的一种抑制剂，是由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环血中胱抑素C几乎仅经肾小球过滤而被清除，是反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标记物【2】【3】，因而,作者认为在判定肾功能损伤时胱抑素C敏感性和特异性优于肌酐及其它低分子蛋白，故展开了本实验：
1 材料和方法
1.1 研究对象 60日龄清洁级WISTAR大鼠60只，全部为雄性，体质量(230±17)g，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（蒙）2002-0001
1.2 药物 分析纯三聚氰胺由长沙金点股份有限公司生产，经出入境检验检疫局检测，样品为三聚氰胺，纯度95％。将三聚氰胺用蒸馏水配制成200g/L浓度。给药前将药物搅拌均匀后吸取，蒸馏水溶液供对照组使用。
1.3 仪器与试剂 Cys-C及生化项目检测使用OLIMPUS公司生产的AU640全自动生化分析仪，北京森美希克玛生物科技有限公司生产的胱抑素C测定试剂盒，试剂分R1和R2两部分，R1为Tris缓冲液（PH6.0-8.0），R2为抗人Cys-C抗体致敏的胶乳微粒。
1.4 检验原理 样本中Cys-C与包被于胶乳微粒上的抗人Cys-C抗体发生特异性结合，使胶乳微粒发生凝集呈现浑浊度，反应液中浊度的变化与样本中Cys-C含量成正比。用已知浓度的校准品制作工作曲线，从该曲线即可求得样品中Cys-C浓度。
1.5 分组与造模 随机将大鼠分成2组，空白对照组10只，给药模型组50只。对照组灌胃蒸馏水2mL／(只·d)，模型组按照1.0g／kg剂量连续灌胃三聚氰胺，给药时间40d。
1.6 检测方法 采血前禁食12h，从连续灌喂3d起每日用乙醚麻醉后行断尾采血法测定血清生化项目，避免溶血，15min后分离血清，2h内完成测定，Cys-C检测采用乳胶增强散射免疫比浊法（PENIA），全自动生化分析仪上酶法测Cr、BUN、β-Mg。
1.7 质量控制 每批测定标本前用标准液进行5点定标，质控测定值在靶值上下10%以内进行标本测定。
1.8 观察指标 连续灌喂40天后解剖观察和取材，取双肾做冠状剖面，剖开膀胱，使用日本Olympus体视显微镜系统，对肾脏、输尿管、膀胱进行观察，拍摄照片直接在电脑中显示和储存，对自排或手术取出的结石在红外光谱自动分析系统进行结石成分测定。
1.9 统计学方法 所有数据采用SPSS13．0统计软件进行统计，各项参数以X土S表示，两样本均数比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况及显微镜观察结果 实验期间60只大鼠全部存活，给药10d出现脱毛、进食少、多尿、个别尿血。给药40d后肾脏、膀胱剖面和输尿管观察比较：对照组肾鲜红色，皮质剖面红褐色，髓质浅红色，肾门处可见肾乳头或肾盏、肾盂、输尿管壁呈粉红色，腔内无结石，膀胱剖面见黏膜呈淡红色，无结石存在。模型组肾明显肿大，表面呈灰黄色，皮髓质交界处可见片状及颗粒状黄色沉淀物，肾结石成模率98%（49/50），膀胱粘膜充血，出现膀胱结石，膀胱结石成模率96%（48/50），总体泌尿系成模率达100%。
2.2 空白对照组和模型组四项指标的比较 连续给药大鼠血清Cys-C，β-Mg ，CREA、BUN含量比较(见表一)(表中结果用X土S表示)。
以上表明随给药天数的增加四项指标逐渐升高，CysC在给药10天和对照组的差异具有统计学意义(P＜0.05)，但β-Mg，CREA、BUN与对照组之间无统计学意义（P>0.05），而在给药20天β-Mg开始升高（P<0.05），CREA、BUN于给药30天升高（P<0.05），表明血清CysC更能早期反映大鼠肾功能的损害。
表一 不同给药时间大鼠血清Cys-C，β-Mg，CREA、BUN含量比较
*与给药对照0天比较 P<0.05
3 讨论
三聚氰胺属三嗪类含氮杂环有机化合物,是一种重要有机化工原料。三聚氰胺毒性轻微，大鼠口服半数致死量大于3克/公斤体重。动物长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。动物肝脏不能转化代谢三聚氰胺,当三聚氰胺摄入体内后，三聚氰胺在胃酸性作用下，网格结构遭到破坏，而相互解离，但由于在体内无法分解转化，而被血液运送到肾脏,在肾脏内依靠水合键又相互结合，再重新形成不溶于水的网格结构的大分子复合物，得以沉积下来，从而形成晶体甚至结石，由于尿液浓缩作用,可能相互聚集或与钙形成结石，这些形成的晶体或结石可造成肾小管阻塞，继而形成肾结石，使尿液不能顺利排出，而导致肾脏积水，同时可出现肾小管坏死、再生和血管炎症等，小管周围纤维化、纤维蛋白血栓形成，甚至导致肾脏衰竭【4】【5】,所以早期诊断肾功能的损害占有重要作用。
评价肾脏功能包括肾小球的滤过功能、肾小管的重吸收及分泌功能，传统习惯一般把CREA、BUN等作为常规项目，血中CREA、BUN通过肾小球滤过进入尿液排出体外，但因肾脏有强大的储备能力和代偿能力，在肾小球受损早期或轻度受损时，CREA、BUN仍可维持在正常水平，只有在严重肾小球损害时BUN浓度才明显升高，更重要的是肾小管对BUN有明显的被动重吸收性，而当GFR下降1／3～1／2时．血CREA才有明显变化，而且受性别、饮食、肌肉量等因素的影响，血β2-Mg由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也可升高，RBP代谢十分复杂，且部分与前白蛋白结合，不能自由经肾小球滤过，故都不是最佳GFR的内源性标志物。
血CysC含量稳定，受年龄、性别、饮食、身体活动、疾病变化的影响较小，即使在炎症状态下，其产生率也不会改变，且也不受大多数药物的影响【6】。上述研究表明：CysC是反映肾功能损害的早期诊断指标，在CREA等小分子蛋白正常时，可以早期增高，其诊断准确性明显优于CREA等低分子蛋白。Newman报道CysC、CREA浓度诊断异常GFR的敏感性分别为78.1%及57.1%，各自浓度倒数与GFR相关系数分别为：0.81、0.50【7】。Kyhse Andersen及Filley的最近临床应用也表明CysC浓度与GFR的相关性优于CREA浓度【8】。研究显示，健康成人CysC随着年龄增长其平均水平呈上升趋势【9】，从而推断CysC在评估老年人肾功能时较肌酐更有意义。由于CysC基因属“管家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故CysC产生率相当恒定。因CysC是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中CysC唯一器官，所以CysC浓度主要由GFR决定，由此可见CysC是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。
参考文献
［1］MUSSAP M，DALLA VESTRA M，FIORETTO P，et al． Cystatin C is a more sensitive marker than creatinine for the estimation of GFR in type 2 diabetic patient ［J］. Kidney Int，2002，61( 4) : 1453 － 1461．
［2］叶应骛 申子瑜等《全国临床检验操作规程》（第三版）
［3］Dharnidharka VR,Kwon C,Steven G.Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function: a meta-analysis[J].Am J Kidney Dis,2002,40(2):221～226.
［4］Puschner B, Poppenga RH, Lowenstine LJ , et al. Assessment of melamine and cyanuric acid toxicity in cats [J]. J Vet Diagn Invest, 2007 , 19 (6) : 616224.
［5］Reimschuessel R, Gieseker CM,Miller RA, et al. Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and p igs [ J ]. Am J Vet Res, 2008, 69 (9) : 121721228.
［6］PASKALEV E，LAMBREVA L，SIMEONOV P，et al． Serum cystatin C in renal transplant patients［J］.Clin Chim Acta，2001， 310( 1) : 53 － 56．
［7］David JN , Hansa T , Robert GD , et al . Serum CystatinC meas2 ured by automated immunoassay : a more sensitive 10arker of changesin GFR t han serum creatinine[J ] . Kidney International , 1995 ,47 :312
［8］Finney H , Newman DJ , Gruber W, et al . Initial evaluation of cystatinC measurement by particle enhanced immunonephelom2 et ry on t he Behring nephelometer systems BNA ,BNII[J ] . Clin Chem ,1997 ,43 :1 016
［9］Fliser D, Ritz E. Ser um cystatin C concentr ation as a mar ker of renal dy sfunct ion in the elderly. Am J Kidney Dis, 2001, 37( 1) : 79.83.
【关键词】 胱抑素C；三聚氰胺；大鼠尿石模型
自三聚氰胺奶粉事件后，食品中添加三聚氰胺含量超标现象屡现，早期测定其对人体的损害，评估肾功能，针对性的及时干预治疗，利于受损肾功能的逆转及远期预后。
致病因素和疾病的出现困扰着健康的同时也促进疾病动物模型的不断创新发展，为临床治疗提供理论依据，本实验采取连续灌喂三聚氰胺建立大鼠尿石模型，利用生化、病理等检测手段评估肾功能的损害，观察组织器官的病变，结石形成情况等。三聚氰胺诱发尿结石会造成肾功能的损害，反映肾功能的损害最重要的指标是肾小球滤过率（GFR），而评价GFR外源性指标包括菊粉、51Cr -EDTA、inIaCgol及99m Tc-二乙烯三胺戊乙醇等一些放射性核物，但因其价格昂贵，具污染性，费时长，操作繁琐等【1】无法常规临床上应用，GFR内源性指标包括血尿素氮(BUN) 、肌酐(Cr)、肌酐清除率(Crcl)、尿酸（UA）、β2微球蛋白(β2-MG)、视黄醇结合蛋白(RBP)、尿氨基糖苷酶（NAG）等低相对分子蛋白，但其分泌量少、血中水平不稳定，存在易受年龄、性别、饮食，炎症、肿瘤、烧伤、肌肉含量等内外因素的影响，都不是理想的标记物，难以早期评定早期肾功能的损害。所以要求寻求一种标记物应具有：（1）恒定的速率入血.（2）血中浓度稳定，不受自身及外界因素变化影响.（3）肾小球完全滤过；不由肾小管重吸收或分泌；经过肾脏排出。
临床上期待一种新的理想的GFR内生标记物，胱抑素C（Cys-C）是一种小分子蛋白质（13KD），是胱氨酸蛋白酶的一种抑制剂，是由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环血中胱抑素C几乎仅经肾小球过滤而被清除，是反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标记物【2】【3】，因而,作者认为在判定肾功能损伤时胱抑素C敏感性和特异性优于肌酐及其它低分子蛋白，故展开了本实验：
1 材料和方法
1.1 研究对象 60日龄清洁级WISTAR大鼠60只，全部为雄性，体质量(230±17)g，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（蒙）2002-0001
1.2 药物 分析纯三聚氰胺由长沙金点股份有限公司生产，经出入境检验检疫局检测，样品为三聚氰胺，纯度95％。将三聚氰胺用蒸馏水配制成200g/L浓度。给药前将药物搅拌均匀后吸取，蒸馏水溶液供对照组使用。
1.3 仪器与试剂 Cys-C及生化项目检测使用OLIMPUS公司生产的AU640全自动生化分析仪，北京森美希克玛生物科技有限公司生产的胱抑素C测定试剂盒，试剂分R1和R2两部分，R1为Tris缓冲液（PH6.0-8.0），R2为抗人Cys-C抗体致敏的胶乳微粒。
1.4 检验原理 样本中Cys-C与包被于胶乳微粒上的抗人Cys-C抗体发生特异性结合，使胶乳微粒发生凝集呈现浑浊度，反应液中浊度的变化与样本中Cys-C含量成正比。用已知浓度的校准品制作工作曲线，从该曲线即可求得样品中Cys-C浓度。
1.5 分组与造模 随机将大鼠分成2组，空白对照组10只，给药模型组50只。对照组灌胃蒸馏水2mL／(只·d)，模型组按照1.0g／kg剂量连续灌胃三聚氰胺，给药时间40d。
1.6 检测方法 采血前禁食12h，从连续灌喂3d起每日用乙醚麻醉后行断尾采血法测定血清生化项目，避免溶血，15min后分离血清，2h内完成测定，Cys-C检测采用乳胶增强散射免疫比浊法（PENIA），全自动生化分析仪上酶法测Cr、BUN、β-Mg。
1.7 质量控制 每批测定标本前用标准液进行5点定标，质控测定值在靶值上下10%以内进行标本测定。
1.8 观察指标 连续灌喂40天后解剖观察和取材，取双肾做冠状剖面，剖开膀胱，使用日本Olympus体视显微镜系统，对肾脏、输尿管、膀胱进行观察，拍摄照片直接在电脑中显示和储存，对自排或手术取出的结石在红外光谱自动分析系统进行结石成分测定。
1.9 统计学方法 所有数据采用SPSS13．0统计软件进行统计，各项参数以X土S表示，两样本均数比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况及显微镜观察结果 实验期间60只大鼠全部存活，给药10d出现脱毛、进食少、多尿、个别尿血。给药40d后肾脏、膀胱剖面和输尿管观察比较：对照组肾鲜红色，皮质剖面红褐色，髓质浅红色，肾门处可见肾乳头或肾盏、肾盂、输尿管壁呈粉红色，腔内无结石，膀胱剖面见黏膜呈淡红色，无结石存在。模型组肾明显肿大，表面呈灰黄色，皮髓质交界处可见片状及颗粒状黄色沉淀物，肾结石成模率98%（49/50），膀胱粘膜充血，出现膀胱结石，膀胱结石成模率96%（48/50），总体泌尿系成模率达100%。
2.2 空白对照组和模型组四项指标的比较 连续给药大鼠血清Cys-C，β-Mg ，CREA、BUN含量比较(见表一)(表中结果用X土S表示)。
以上表明随给药天数的增加四项指标逐渐升高，CysC在给药10天和对照组的差异具有统计学意义(P＜0.05)，但β-Mg，CREA、BUN与对照组之间无统计学意义（P>0.05），而在给药20天β-Mg开始升高（P<0.05），CREA、BUN于给药30天升高（P<0.05），表明血清CysC更能早期反映大鼠肾功能的损害。
表一 不同给药时间大鼠血清Cys-C，β-Mg，CREA、BUN含量比较
*与给药对照0天比较 P<0.05
3 讨论
三聚氰胺属三嗪类含氮杂环有机化合物,是一种重要有机化工原料。三聚氰胺毒性轻微，大鼠口服半数致死量大于3克/公斤体重。动物长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。动物肝脏不能转化代谢三聚氰胺,当三聚氰胺摄入体内后，三聚氰胺在胃酸性作用下，网格结构遭到破坏，而相互解离，但由于在体内无法分解转化，而被血液运送到肾脏,在肾脏内依靠水合键又相互结合，再重新形成不溶于水的网格结构的大分子复合物，得以沉积下来，从而形成晶体甚至结石，由于尿液浓缩作用,可能相互聚集或与钙形成结石，这些形成的晶体或结石可造成肾小管阻塞，继而形成肾结石，使尿液不能顺利排出，而导致肾脏积水，同时可出现肾小管坏死、再生和血管炎症等，小管周围纤维化、纤维蛋白血栓形成，甚至导致肾脏衰竭【4】【5】,所以早期诊断肾功能的损害占有重要作用。
评价肾脏功能包括肾小球的滤过功能、肾小管的重吸收及分泌功能，传统习惯一般把CREA、BUN等作为常规项目，血中CREA、BUN通过肾小球滤过进入尿液排出体外，但因肾脏有强大的储备能力和代偿能力，在肾小球受损早期或轻度受损时，CREA、BUN仍可维持在正常水平，只有在严重肾小球损害时BUN浓度才明显升高，更重要的是肾小管对BUN有明显的被动重吸收性，而当GFR下降1／3～1／2时．血CREA才有明显变化，而且受性别、饮食、肌肉量等因素的影响，血β2-Mg由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也可升高，RBP代谢十分复杂，且部分与前白蛋白结合，不能自由经肾小球滤过，故都不是最佳GFR的内源性标志物。
血CysC含量稳定，受年龄、性别、饮食、身体活动、疾病变化的影响较小，即使在炎症状态下，其产生率也不会改变，且也不受大多数药物的影响【6】。上述研究表明：CysC是反映肾功能损害的早期诊断指标，在CREA等小分子蛋白正常时，可以早期增高，其诊断准确性明显优于CREA等低分子蛋白。Newman报道CysC、CREA浓度诊断异常GFR的敏感性分别为78.1%及57.1%，各自浓度倒数与GFR相关系数分别为：0.81、0.50【7】。Kyhse Andersen及Filley的最近临床应用也表明CysC浓度与GFR的相关性优于CREA浓度【8】。研究显示，健康成人CysC随着年龄增长其平均水平呈上升趋势【9】，从而推断CysC在评估老年人肾功能时较肌酐更有意义。由于CysC基因属“管家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故CysC产生率相当恒定。因CysC是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中CysC唯一器官，所以CysC浓度主要由GFR决定，由此可见CysC是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。
参考文献
［1］MUSSAP M，DALLA VESTRA M，FIORETTO P，et al． Cystatin C is a more sensitive marker than creatinine for the estimation of GFR in type 2 diabetic patient ［J］. Kidney Int，2002，61( 4) : 1453 － 1461．
［2］叶应骛 申子瑜等《全国临床检验操作规程》（第三版）
［3］Dharnidharka VR,Kwon C,Steven G.Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function: a meta-analysis[J].Am J Kidney Dis,2002,40(2):221～226.
［4］Puschner B, Poppenga RH, Lowenstine LJ , et al. Assessment of melamine and cyanuric acid toxicity in cats [J]. J Vet Diagn Invest, 2007 , 19 (6) : 616224.
［5］Reimschuessel R, Gieseker CM,Miller RA, et al. Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and p igs [ J ]. Am J Vet Res, 2008, 69 (9) : 121721228.
［6］PASKALEV E，LAMBREVA L，SIMEONOV P，et al． Serum cystatin C in renal transplant patients［J］.Clin Chim Acta，2001， 310( 1) : 53 － 56．
［7］David JN , Hansa T , Robert GD , et al . Serum CystatinC meas2 ured by automated immunoassay : a more sensitive 10arker of changesin GFR t han serum creatinine[J ] . Kidney International , 1995 ,47 :312
［8］Finney H , Newman DJ , Gruber W, et al . Initial evaluation of cystatinC measurement by particle enhanced immunonephelom2 et ry on t he Behring nephelometer systems BNA ,BNII[J ] . Clin Chem ,1997 ,43 :1 016
［9］Fliser D, Ritz E. Ser um cystatin C concentr ation as a mar ker of renal dy sfunct ion in the elderly. Am J Kidney Dis, 2001, 37( 1) : 79.83.