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【摘要】目的：探讨瘦素对人卵体外成熟和早期胚胎发育的影响。方法：选取2009年06月～ 2011年08月的在广西人口和计划生育研究中心就诊的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母细胞共120枚。随机分为4组，每组30枚，分别进行体外成熟培养，同时加入瘦素蛋白（美国Sigma公司产品），作用浓度分别为0、10、20、100 ng/ml，比较每组不成熟卵母细胞的成熟度、卵裂数、囊胚数以及受精率和优质胚胎率。结果：观察瘦素对人未成熟卵母细胞体外成熟的影响发现，添加瘦素浓度为10 ng/ml的人卵母细胞成熟率（以极体排出率为指标）及囊胚发育数明显高于其他三组（P<0.05），而瘦素浓度为100与200 ng/ml时卵母细胞成熟率与囊胚发育数相差不大（P>0.05），各组卵裂数无明显差异（P>0.05）;进一步了解瘦素对体外培养阶段的影响发现，添加瘦素浓度为10 ng/ml的囊胚发育数最高，其次为100 ng/mL瘦素处理组，明显高于其他两组（P<0.05），各组卵裂数无明显差异（P>0.05）。另外人瘦素蛋白有2个共同的强柔区、3个共同的表面可及性区、1个共同表面裸露区、1个共同的极性区，二级结构中的α螺旋、伸链、Beta转角、规则卷曲比例中，以α螺旋占比最高。结论：瘦素有利于人体获得更多的成熟卵母细胞及优质胚胎，其中添加10 ng/mL瘦素能够最大限度提高体外成熟率，效果最明显。
【关键词】人瘦素基因的克隆及在酿酒酵母中的表达和生物信息学分析
【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2020）03-005-02
人卵体外成熟是一种新的人类辅助生殖技术，应用于人类不孕症治疗中具有深远的影响。当前，应用卵母细胞IVM已成为当前辅助生育技术的研究热点。但这项技术目前尚不完善，需要对各种因素加以探讨。本研究通过对不成熟卵母细胞在体外成熟培养中加入不同浓度的瘦素，观察不成熟卵母细胞的发育、受精和卵裂情况，探讨瘦素对人卵体外成熟和早期胚胎发育的影响，更深入地了解人类卵子和早期胚胎发育的机制，以获得安全有效简便的培养方法以及更多的成熟卵母细胞及优质胚胎。但目前国外关于不同浓度瘦素对人不成熟卵母细胞的影响的报道很少，我国尚无相关报道[1]。鉴于此，本研究选取了2009年06月～ 2011年08月的在广西人口和计划生育研究中心就诊的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母细胞共120枚，进行体外成熟培养，同时加入不同浓度的瘦素蛋白，观察其作用效果，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选取2009年06月～ 2011年08月的在广西人口和计划生育研究中心就诊的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母细胞共120枚。随机分为4组，每组30枚，分别进行体外成熟培养，同时加入瘦素蛋白（美国Sigma公司产品），作用浓度分别为0、10、20、100 ng/ml，所有过程事先经广西人口和计划生育研究中心生殖医学伦理委员会讨论通过并经患者双方知情同意并签字的情况下进行。
1.2 方法
1.2.1 卵母细胞采集及体外成熟培养
观察每组不成熟卵母细胞的成熟度，如发育为成熟卵母細胞，采用常规单精子卵浆内注射（ICSI）法进行受精，ICSI后12～ 16h观察受精情况，正常受精卵在含10%血清的P-1（Irvine公司，美国）培养液微滴中培养，每隔24h观察胚胎发育情况，以卵裂速度正常、卵裂球均一或大致均一、低于10%碎片的胚胎判为优质胚胎。将卵丘-卵母细胞复合体置于成熟培养液微滴中培养（10～ 15枚/100μL/滴，微滴上覆盖矿物油）。培养条件为37℃、5%C02、饱和湿度。成熟培养液中含促性腺激素、雌二醇等各种因子（成熟培养液配方国家专利受理号： 0211260819）。卵丘充分扩散后终止培养，0.1%透明质酸酶消化，以排出第一极体判定为成熟卵母细胞。
1.2.2 卵母细胞成熟度评定
行ICSI 治疗者体视显微镜下确定每份卵泡液对应卵母细胞的成熟度。①成熟卵母细胞：卵丘松散，放射冠放射状排列，可见透明带和第一极体;②不成熟卵母细胞：卵丘紧密，放射冠紧包卵子，透明带不清楚，无第一极体。
1.2.3 受精卵及胚胎观察
加入精子12 ～16h后，体视显微镜下观察卵子的受精情况。卵子受精标准：出现第二极体，卵细胞内出现2个原核。取卵后第3天观察胚胎发育 情况，根据卵裂球均匀程度和碎片多少，评价胚胎质量：①1级胚胎，卵裂球大小均匀，无碎片;②级胚胎，卵裂球大小不均匀，碎片<10%;③级胚胎，卵裂球大小不均匀，碎片在10 %～50 %之间;④IV级胚胎，卵裂球大小不均匀，碎片> 50 %。
1.4 统计学处理[1]
采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行分析处理，计数资料采用百分比表示，卡方检验;计量资料用（ ）表示，t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1瘦素对人未成熟卵母细胞体外成熟的影响
结果发现，添加瘦素浓度为10 ng/ml的人卵母细胞成熟率（以极体排出率为指标）及囊胚发育数明显高于其他三组（P<0.05），而瘦素浓度为100与200 ng/ml时卵母细胞成熟率与囊胚发育数相差不大（P>0.05），各组卵裂数无明显差异（P>0.05），详见表1。
2.2 瘦素对人卵母细胞体外受精后胚胎培养的影响
添加瘦素浓度为10 ng/ml的囊胚发育数最高，其次为100 ng/mL瘦素处理组，明显高于其他两组（P<0.05），各组卵裂数无明显差异（P>0.05），详见表2。
2.3 瘦素蛋白的强柔性区域、表面可及区域、表面裸露区域、极性区域 采用Bcepred软件的Flexibility、Accessibility、Exposed Surface、Polarity分析蛋白质的强柔性区域、表面可及区域、表面裸露区域、极性区域，如表2。
2.4 瘦素蛋白二级结构
采用SOPMA程序分析瘦素蛋白二级结构，使用Bcepred软件的Turns选项分析瘦素蛋白的β转角。从表4及图1可看出，人的瘦素蛋白二级结构的组成比例相似，且各阿尔法螺旋的位置相近或相同，提示功能相近。
3 讨论
1939年Pincus和Saunders证实人未成熟卵母细胞在体外能自发成熟，1969年Edwards进一步发现人体外成熟（ IVM）卵母细胞能完成体外受精。1991年Cha等利用IVM技术在世界上获得了首例妊娠。从此IVM作为辅助生殖技术中的一项前沿技术，越来越多地被应用于临床，帮助一些卵子成熟障碍的患者获得妊娠[2]。在IVP治疗周期中卵子的发育不良和卵泡发育迟缓一直是一个困难的问题，通常这些周期有很高的取消率，发掘一种有效提高人卵母细胞体外成熟率的技术，对提高临床妊娠率将起到至关重要的作用。
瘦素（leptin）是1994年被发现的一种蛋白激素，系16-KDa非糖基化多肽，含有46个氨基酸，是肥胖基因（Ob基因）的激素产物0b基因主要表达于脂肪组织，在下丘脑、垂体、骨骼肌、乳腺、性腺、胎盘等器官低水平表达。近年来不断有研究提出，瘦素在鼠、人的卵和移植前胚胎中都有表达。鉴于此，本研究通过探讨向成熟液添加不同浓度的瘦素对人卵体外成熟效果的影响，阐明瘦素对调控人卵体外成熟的作用。结果显示：添加瘦素浓度为10 ng/ml的人卵母细胞成熟率（以极体排出率为指标）及囊胚发育数最高，同时有助于激发体外受精后的胚胎发育潜能，提高体外受精囊胚发育率，其原因可能為瘦素能够激活卵母细胞中磷酸二酯酶3B（PDE3B），从而降低卵母细胞中cAMP水平，启动胚泡破裂，从而加速卵母细胞成熟。国外亦有学者发现在排卵前的小树卵泡培养环境里添加瘦素，可以增加后来的胚泡破裂比率[3]。
综上所述，瘦素对人卵体外成熟的意义重大，其中以10 ng/ml瘦素处理浓度为最佳，不仅能提高体外成熟率，还能激发体外受精后的胚胎发育潜能，提高体外受精囊胚发育率，这项技术将对降低病患者的治疗费用和副作用，造福不孕症患者，起到积极的作用。
参考文献
[1]陆阳清，罗茜，江明生等.瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响[J].南方农业学报，2012，43（5）：697-700.
[2]易芳，刁莎，袁雪莲等.血浆瘦素及可溶性瘦素受体与女性乳腺癌的相关性研究[J].中华预防医学杂志，2018，52（3）：253-259.
[3]蔡恒，骆倩倩，张新泽等.下丘脑弓状核瘦素/瘦素受体-吻素/吻素受体系统对大鼠卵泡发育的影响[J].解剖学杂志，2016，39（4）：397-400，408.
1.广西壮族自治区计划生育委员会科研课题，合同号：桂人口计生研0904
2.广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题，合同号：Z2016374
通讯作者：黄卡立，[email protected]
【关键词】人瘦素基因的克隆及在酿酒酵母中的表达和生物信息学分析
【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2020）03-005-02
人卵体外成熟是一种新的人类辅助生殖技术，应用于人类不孕症治疗中具有深远的影响。当前，应用卵母细胞IVM已成为当前辅助生育技术的研究热点。但这项技术目前尚不完善，需要对各种因素加以探讨。本研究通过对不成熟卵母细胞在体外成熟培养中加入不同浓度的瘦素，观察不成熟卵母细胞的发育、受精和卵裂情况，探讨瘦素对人卵体外成熟和早期胚胎发育的影响，更深入地了解人类卵子和早期胚胎发育的机制，以获得安全有效简便的培养方法以及更多的成熟卵母细胞及优质胚胎。但目前国外关于不同浓度瘦素对人不成熟卵母细胞的影响的报道很少，我国尚无相关报道[1]。鉴于此，本研究选取了2009年06月～ 2011年08月的在广西人口和计划生育研究中心就诊的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母细胞共120枚，进行体外成熟培养，同时加入不同浓度的瘦素蛋白，观察其作用效果，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选取2009年06月～ 2011年08月的在广西人口和计划生育研究中心就诊的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母细胞共120枚。随机分为4组，每组30枚，分别进行体外成熟培养，同时加入瘦素蛋白（美国Sigma公司产品），作用浓度分别为0、10、20、100 ng/ml，所有过程事先经广西人口和计划生育研究中心生殖医学伦理委员会讨论通过并经患者双方知情同意并签字的情况下进行。
1.2 方法
1.2.1 卵母细胞采集及体外成熟培养
观察每组不成熟卵母细胞的成熟度，如发育为成熟卵母細胞，采用常规单精子卵浆内注射（ICSI）法进行受精，ICSI后12～ 16h观察受精情况，正常受精卵在含10%血清的P-1（Irvine公司，美国）培养液微滴中培养，每隔24h观察胚胎发育情况，以卵裂速度正常、卵裂球均一或大致均一、低于10%碎片的胚胎判为优质胚胎。将卵丘-卵母细胞复合体置于成熟培养液微滴中培养（10～ 15枚/100μL/滴，微滴上覆盖矿物油）。培养条件为37℃、5%C02、饱和湿度。成熟培养液中含促性腺激素、雌二醇等各种因子（成熟培养液配方国家专利受理号： 0211260819）。卵丘充分扩散后终止培养，0.1%透明质酸酶消化，以排出第一极体判定为成熟卵母细胞。
1.2.2 卵母细胞成熟度评定
行ICSI 治疗者体视显微镜下确定每份卵泡液对应卵母细胞的成熟度。①成熟卵母细胞：卵丘松散，放射冠放射状排列，可见透明带和第一极体;②不成熟卵母细胞：卵丘紧密，放射冠紧包卵子，透明带不清楚，无第一极体。
1.2.3 受精卵及胚胎观察
加入精子12 ～16h后，体视显微镜下观察卵子的受精情况。卵子受精标准：出现第二极体，卵细胞内出现2个原核。取卵后第3天观察胚胎发育 情况，根据卵裂球均匀程度和碎片多少，评价胚胎质量：①1级胚胎，卵裂球大小均匀，无碎片;②级胚胎，卵裂球大小不均匀，碎片<10%;③级胚胎，卵裂球大小不均匀，碎片在10 %～50 %之间;④IV级胚胎，卵裂球大小不均匀，碎片> 50 %。
1.4 统计学处理[1]
采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行分析处理，计数资料采用百分比表示，卡方检验;计量资料用（ ）表示，t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1瘦素对人未成熟卵母细胞体外成熟的影响
结果发现，添加瘦素浓度为10 ng/ml的人卵母细胞成熟率（以极体排出率为指标）及囊胚发育数明显高于其他三组（P<0.05），而瘦素浓度为100与200 ng/ml时卵母细胞成熟率与囊胚发育数相差不大（P>0.05），各组卵裂数无明显差异（P>0.05），详见表1。
2.2 瘦素对人卵母细胞体外受精后胚胎培养的影响
添加瘦素浓度为10 ng/ml的囊胚发育数最高，其次为100 ng/mL瘦素处理组，明显高于其他两组（P<0.05），各组卵裂数无明显差异（P>0.05），详见表2。
2.3 瘦素蛋白的强柔性区域、表面可及区域、表面裸露区域、极性区域 采用Bcepred软件的Flexibility、Accessibility、Exposed Surface、Polarity分析蛋白质的强柔性区域、表面可及区域、表面裸露区域、极性区域，如表2。
2.4 瘦素蛋白二级结构
采用SOPMA程序分析瘦素蛋白二级结构，使用Bcepred软件的Turns选项分析瘦素蛋白的β转角。从表4及图1可看出，人的瘦素蛋白二级结构的组成比例相似，且各阿尔法螺旋的位置相近或相同，提示功能相近。
3 讨论
1939年Pincus和Saunders证实人未成熟卵母细胞在体外能自发成熟，1969年Edwards进一步发现人体外成熟（ IVM）卵母细胞能完成体外受精。1991年Cha等利用IVM技术在世界上获得了首例妊娠。从此IVM作为辅助生殖技术中的一项前沿技术，越来越多地被应用于临床，帮助一些卵子成熟障碍的患者获得妊娠[2]。在IVP治疗周期中卵子的发育不良和卵泡发育迟缓一直是一个困难的问题，通常这些周期有很高的取消率，发掘一种有效提高人卵母细胞体外成熟率的技术，对提高临床妊娠率将起到至关重要的作用。
瘦素（leptin）是1994年被发现的一种蛋白激素，系16-KDa非糖基化多肽，含有46个氨基酸，是肥胖基因（Ob基因）的激素产物0b基因主要表达于脂肪组织，在下丘脑、垂体、骨骼肌、乳腺、性腺、胎盘等器官低水平表达。近年来不断有研究提出，瘦素在鼠、人的卵和移植前胚胎中都有表达。鉴于此，本研究通过探讨向成熟液添加不同浓度的瘦素对人卵体外成熟效果的影响，阐明瘦素对调控人卵体外成熟的作用。结果显示：添加瘦素浓度为10 ng/ml的人卵母细胞成熟率（以极体排出率为指标）及囊胚发育数最高，同时有助于激发体外受精后的胚胎发育潜能，提高体外受精囊胚发育率，其原因可能為瘦素能够激活卵母细胞中磷酸二酯酶3B（PDE3B），从而降低卵母细胞中cAMP水平，启动胚泡破裂，从而加速卵母细胞成熟。国外亦有学者发现在排卵前的小树卵泡培养环境里添加瘦素，可以增加后来的胚泡破裂比率[3]。
综上所述，瘦素对人卵体外成熟的意义重大，其中以10 ng/ml瘦素处理浓度为最佳，不仅能提高体外成熟率，还能激发体外受精后的胚胎发育潜能，提高体外受精囊胚发育率，这项技术将对降低病患者的治疗费用和副作用，造福不孕症患者，起到积极的作用。
参考文献
[1]陆阳清，罗茜，江明生等.瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响[J].南方农业学报，2012，43（5）：697-700.
[2]易芳，刁莎，袁雪莲等.血浆瘦素及可溶性瘦素受体与女性乳腺癌的相关性研究[J].中华预防医学杂志，2018，52（3）：253-259.
[3]蔡恒，骆倩倩，张新泽等.下丘脑弓状核瘦素/瘦素受体-吻素/吻素受体系统对大鼠卵泡发育的影响[J].解剖学杂志，2016，39（4）：397-400，408.
1.广西壮族自治区计划生育委员会科研课题，合同号：桂人口计生研0904
2.广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题，合同号：Z2016374
通讯作者：黄卡立，[email protected]