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摘要 [目的]建立台兰稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA，并对影响台兰ISSR-PCR反应体系的主要成分进行筛选和优化。[结果]台兰的ISSR-PCR优化反应体系为：25 μl PCR反应体积中，2.5 μl 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，100 ng模板DNA，0.5 mmol/L dNTPs，0.22 U Taq DNA 聚合酶，0.4 μmol/L 引物，15.78 μl双蒸水。最佳扩增程序为：94 ℃预变性5 min，然后进行40个循环：94 ℃变性30 s，复性温度根据各引物的TM值略低1～2 ℃，30 s，72 ℃延伸50 s，循环结束后72 ℃延伸7 min。[结论] 台兰ISSR-PCR优化反应体系为今后利用ISSR技术进行台兰种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。
关键词 台兰（Cymbidium floribundum var.pumilum）；ISSR分子标记；ISSR-PCR反应体系
中图分类号 S682.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）15-04583-04
Abstract [Objective] This research aimed to establish the optimized ISSR-PCR reaction system ofCymbidium floribundum var. pumilum. [Method] The genomic DNA from fresh leaves was extracted according to the modified CTAB method. Different factors that affected ISSR amplification reaction were optimized. [Result] High-quality genomic DNA was obtained from Cymbidium floribundum var. pumilum. The 25 μl optimized ISSR-PCR reaction mixture contained 2.5 μl 10×PCR buffer， 2.0 mmol/L MgCl2， 100 ng template DNA， 0.22 U Taq DNA polymerase， 0.5 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer and 15.78 μl ddH2O. The PCR was performed as follow： an initial step of 5 min at 94 ℃， named pre-denaturing， followed by 40 cycles of denaturing at 94 ℃ for 30 s， annealing for 30 s due to 1-2 ℃ lower than denaturing temperature of different primers， extension for 50 s at 72 ℃， and a 7 min final extension step at 72 ℃. [Conclusion] The optimal system was established and it could provide a favorable basis for further study on genetic diversity of C. floribundum var. pumilum， using ISSR molecular marker.
Key words C. floribundum var. pumilum； ISSR； ISSR-PCR reaction system
台兰（Cymbidium floribundum var.pumilum ）又名蜜蜂兰、蜂子兰、金棱边、蒲兰等，为兰科 （Orchidaceae）兰属（Cymbidium）多年半地生性兰科植物。兰花的种质资源是选种育种的基础，种质资源一旦灭绝，无法再造，从这一意义上来说，野生兰花若再不加以保护，将会对世界兰花的育种、研究造成不可弥补的损失，并将会直接威胁到我国兰花经济的持续发展。目前，关于兰科植物的研究主要集中在形态学、分类学、生理学、孢粉学、区系地理学和繁殖生物学等方面[1-2]，而关于居群遗传学的研究则很少。
近年来，应用 ISSR-PCR 分子标记技术对植物进行遗传多样性研究已有较多报道[3-5]，而采用ISSR技术对野生台兰的遗传多样性和居群遗传结构进行的研究鲜有报道。笔者以采自江西省赣州市齐云山的台兰作为试验材料，对台兰ISSR-PCR反应体系进行优化，以建立比较完善的反应条件，以期为建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行台兰遗传多样性研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料 试验样品采自江西省赣州市齐云山的一个自然居群，每个居群采集 15～20个样本。记录采集样品的经纬度、海拔和生境，同时对每个居群采集凭证标本供研究用。采集完成后用硅胶干燥法进行处理、保存，备用。
1.2 基因组 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法提取台兰基因组DNA，步骤如下：①取0.05 g硅胶干燥的台兰叶片材料，置于1.5 ml离心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75 ml 65 ℃预热的2×CTAB抽提缓冲液（ pH8.0），20 μl β-硫基乙醇，轻轻摇动使溶液分散均匀，65 ℃水浴1 h，水浴过程每隔10 min轻轻摇动。②冷却至室温，加等体积的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），混合均匀，12 000 r/min离心10 min。③吸取上层液相转入新的1.5 ml离心管，加等体积氯仿异戊醇，摇匀。④12 000 r/min离心10 min。取上层液相，加1/10体积3 mol/L的冰醋酸钠，2倍体积-20 ℃的无水乙醇，-20 ℃保存20 min。⑤勾出 DNA。⑥加70 %乙醇洗涤2 次，用无水乙醇洗涤1 次，风干。⑦用40 μl 0.1TE溶解 DNA，-20 ℃长期保存备用。 1.3 DNA 样品的检测 用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量；用分光光度计测定其纯度和浓度，DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算，浓度估算法为：DNA 浓度 （ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（ DNA量/所用叶片量×100%）为1.8%。
1.4 ISSR-PCR 扩增反应
1.4.1 ISSR-PCR 条件筛选。反应体系为25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物浓度为0.4 μmol/L，双蒸水15.78 μl。为确定 PCR 反应中其他4项因素 （ DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs ） 的最佳水平，试验用引物对 ISSR-PCR 反应的这4项影响因素逐个进行5个水平的研究，各反应参数变化量见表 1。反应总体积为25 μl （含2.5 μl 10×buffer和15.78 μl ddH2O）。
1.4.3 PCR 扩增步骤及参数。取1.5 ml已灭菌eppendorf管，依扩增的样本数计算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs →Taq酶，混匀后分装到各扩增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入 PCR 扩增仪样本中，按以下程序进行扩增。扩增完毕，将样本取出，置于4 ℃ 冰箱保存，等待电泳。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收纯化目的条带。
1.5 电泳与拍照 PCR 扩增结束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus（上海生物工程公司产品SM0321 ）为分子量标记，用含有0.1% EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳（0.6 g琼脂糖，40 ml 1×TAE缓冲液），电泳缓冲液为1×TAE 电泳缓冲液100 V稳压100 mA电泳45～60 min，凝胶成像仪下成像拍照并保存。
2 结果与分析
2.1 Taq DNA 聚合酶对 ISSR-PCR 反应的影响 试验设计了 Taq DNA 聚合酶5个浓度梯度为0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同时对5个引物18291、18294、18295、18297和18298进行筛选。图1表明，当 Taq DNA 聚合酶浓度为0.18和0.20 U 时，扩增谱带模糊不清；浓度为0.20、0.25、0.28 U时，扩增谱带较弱，且数量相对较少；浓度为0.22 U时扩增条带较多且较亮，效果最好，故确定为最佳浓度。同时可以看出引物18257和18297的条带较为清晰而且数量较多，筛选出效果较好的引物为18257和18297。
2.2 dNTPs 浓度对 ISSR- PCR 反应的影响 图2表明，当浓度为0.3 mmol/L时，几乎无扩增产物；在0.4 mmol/L时，虽有扩增产物，但谱带较弱不易辨认；浓度为0.5～0.7 mmol/L时，均能扩增出清晰的谱带，但在0.6～0.7 mmol/L，扩增产物不稳定且有非特异性扩增；在0.6 mmol/L时，扩增谱带较弱或一些大的片段扩增缺失。考虑到结果的稳定性和减少试验成本，选用0.5 mmol/L 的dNTPs浓度，在此浓度下，扩增产物稳定、重复性强。同时对引物18262、18265、18266、18268和18269进行筛选，得出18265和18269扩增效果较好。
2.5 台兰优化体系的建立 通过对以上各种影响因素的分析优化，建立了反应稳定、重复性好的台兰ISSR-PCR 反应体系：在25 μl 反应体系中含2.5 μl 10×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，0.22 U Taq DNA 聚合酶，100 ng模板 DNA，双蒸水15.78 μl。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火（退火温度随引物不同而定，根据各引物的Tm值略低1～2 ℃）30 s，72 ℃延伸50 s，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
为了检测优化的效果，试验利用建立的优化体系，选用UBC822引物，在复性温度为50 ℃条件下，对12个筛选的引物进行批量扩增。图5表明，优化后的反应体系是比较理想的。
3 结论与讨论
3.1 ISSR 反应体系主要成分对ISSR-PCR反应稳定性的影响 ISSR是基于PCR反应的一种分子标记技术，具有DNA用量少、操作简单、快速灵敏、成本低等优点[6]，但ISSR-PCR扩增反应容易受许多因素的影响，如：Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度、dNTPs用量、DNA模板的浓度和纯度等，而且这些因素之间存在相互作用。因此，不同物种的最佳扩增条件各有不同，为确保 ISSR 分析结果的可靠性和重复性，获得较高的 ISSR-PCR扩增谱带，提高分析的准确性，针对不同物种相应的反应体系中各种影响因子进行优化，筛选出最适宜的ISSR-PCR扩增反应条件非常重要。
在ISSR-PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶的用量直接决定着实验的成功与否，量多不仅增加试验成本而且容易产生非特异性扩增产物；量少则会使酶过早地消耗完，产物合成效率低[7]。试验中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U时条带数量少且比较暗，用量多于0.22 U时条带虽然没有减少，但是出现了非特异性扩增产物，结果表明0.22 U是台兰ISSR-PCR反应的最佳条件。
dNTPs是ISSR-PCR反应的原料，通常dNTPs浓度范围为0.02～0.20 mmol/L[8]。dNTPs为Taq DNA聚合酶提供底物，使产物得以延伸。当dNTPs浓度过高，则导致Taq DNA聚合酶的错误掺入，会导致PCR错配，从而使扩增出现非特异性扩增，影响扩增的准确性；浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因过早的消耗而使产物单链化，影响扩增效果[9]。试验中dNTPs浓度为0.3和0.4 mmol/L时，因浓度太低而扩增产物过少，浓度为0.5、0.6和0.7 mmol/L时都有较多扩增产物，但后两者非特异性扩增相对较多，结果表明0.5 mmol/L为dNTPs最佳浓度。
Mg2+浓度是影响ISSR-PCR结果的一个重要因素，Mg2+浓度不仅影响Taq酶的活性[10]，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物结合，影响引物与模板的合效率、模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成[11]。试验中Mg2+浓度对反应无明显影响，所设置的几个浓度都有较多扩增产物，但浓度为2.0 mmol/L时条带较亮，结果表明2.0 mmol/L为Mg2+ 最佳浓度。
DNA模板浓度也是影响ISSR-PCR扩增效果的因素之一，浓度过低，扩增产物不稳定或无扩增产物；浓度过高，又会相应增加非特异性产物的扩增。最佳的模板浓度范围取决于研究的物种和模板纯度，在DNA模板不纯的情况下，宁可使用有效浓度范围内的最低浓度，使抑制Taq DNA 聚合酶的影响降到最小。试验中随着DNA模板浓度升高，扩增产物也相应增加，但同时非特异性产物也在增加，因此，考虑到稳定性和节约成本，试验采用的最佳DNA模板浓度为100 ng/L。
关键词 台兰（Cymbidium floribundum var.pumilum）；ISSR分子标记；ISSR-PCR反应体系
中图分类号 S682.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）15-04583-04
Abstract [Objective] This research aimed to establish the optimized ISSR-PCR reaction system ofCymbidium floribundum var. pumilum. [Method] The genomic DNA from fresh leaves was extracted according to the modified CTAB method. Different factors that affected ISSR amplification reaction were optimized. [Result] High-quality genomic DNA was obtained from Cymbidium floribundum var. pumilum. The 25 μl optimized ISSR-PCR reaction mixture contained 2.5 μl 10×PCR buffer， 2.0 mmol/L MgCl2， 100 ng template DNA， 0.22 U Taq DNA polymerase， 0.5 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer and 15.78 μl ddH2O. The PCR was performed as follow： an initial step of 5 min at 94 ℃， named pre-denaturing， followed by 40 cycles of denaturing at 94 ℃ for 30 s， annealing for 30 s due to 1-2 ℃ lower than denaturing temperature of different primers， extension for 50 s at 72 ℃， and a 7 min final extension step at 72 ℃. [Conclusion] The optimal system was established and it could provide a favorable basis for further study on genetic diversity of C. floribundum var. pumilum， using ISSR molecular marker.
Key words C. floribundum var. pumilum； ISSR； ISSR-PCR reaction system
台兰（Cymbidium floribundum var.pumilum ）又名蜜蜂兰、蜂子兰、金棱边、蒲兰等，为兰科 （Orchidaceae）兰属（Cymbidium）多年半地生性兰科植物。兰花的种质资源是选种育种的基础，种质资源一旦灭绝，无法再造，从这一意义上来说，野生兰花若再不加以保护，将会对世界兰花的育种、研究造成不可弥补的损失，并将会直接威胁到我国兰花经济的持续发展。目前，关于兰科植物的研究主要集中在形态学、分类学、生理学、孢粉学、区系地理学和繁殖生物学等方面[1-2]，而关于居群遗传学的研究则很少。
近年来，应用 ISSR-PCR 分子标记技术对植物进行遗传多样性研究已有较多报道[3-5]，而采用ISSR技术对野生台兰的遗传多样性和居群遗传结构进行的研究鲜有报道。笔者以采自江西省赣州市齐云山的台兰作为试验材料，对台兰ISSR-PCR反应体系进行优化，以建立比较完善的反应条件，以期为建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行台兰遗传多样性研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料 试验样品采自江西省赣州市齐云山的一个自然居群，每个居群采集 15～20个样本。记录采集样品的经纬度、海拔和生境，同时对每个居群采集凭证标本供研究用。采集完成后用硅胶干燥法进行处理、保存，备用。
1.2 基因组 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法提取台兰基因组DNA，步骤如下：①取0.05 g硅胶干燥的台兰叶片材料，置于1.5 ml离心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75 ml 65 ℃预热的2×CTAB抽提缓冲液（ pH8.0），20 μl β-硫基乙醇，轻轻摇动使溶液分散均匀，65 ℃水浴1 h，水浴过程每隔10 min轻轻摇动。②冷却至室温，加等体积的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），混合均匀，12 000 r/min离心10 min。③吸取上层液相转入新的1.5 ml离心管，加等体积氯仿异戊醇，摇匀。④12 000 r/min离心10 min。取上层液相，加1/10体积3 mol/L的冰醋酸钠，2倍体积-20 ℃的无水乙醇，-20 ℃保存20 min。⑤勾出 DNA。⑥加70 %乙醇洗涤2 次，用无水乙醇洗涤1 次，风干。⑦用40 μl 0.1TE溶解 DNA，-20 ℃长期保存备用。 1.3 DNA 样品的检测 用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量；用分光光度计测定其纯度和浓度，DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算，浓度估算法为：DNA 浓度 （ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（ DNA量/所用叶片量×100%）为1.8%。
1.4 ISSR-PCR 扩增反应
1.4.1 ISSR-PCR 条件筛选。反应体系为25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物浓度为0.4 μmol/L，双蒸水15.78 μl。为确定 PCR 反应中其他4项因素 （ DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs ） 的最佳水平，试验用引物对 ISSR-PCR 反应的这4项影响因素逐个进行5个水平的研究，各反应参数变化量见表 1。反应总体积为25 μl （含2.5 μl 10×buffer和15.78 μl ddH2O）。
1.4.3 PCR 扩增步骤及参数。取1.5 ml已灭菌eppendorf管，依扩增的样本数计算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs →Taq酶，混匀后分装到各扩增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入 PCR 扩增仪样本中，按以下程序进行扩增。扩增完毕，将样本取出，置于4 ℃ 冰箱保存，等待电泳。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收纯化目的条带。
1.5 电泳与拍照 PCR 扩增结束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus（上海生物工程公司产品SM0321 ）为分子量标记，用含有0.1% EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳（0.6 g琼脂糖，40 ml 1×TAE缓冲液），电泳缓冲液为1×TAE 电泳缓冲液100 V稳压100 mA电泳45～60 min，凝胶成像仪下成像拍照并保存。
2 结果与分析
2.1 Taq DNA 聚合酶对 ISSR-PCR 反应的影响 试验设计了 Taq DNA 聚合酶5个浓度梯度为0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同时对5个引物18291、18294、18295、18297和18298进行筛选。图1表明，当 Taq DNA 聚合酶浓度为0.18和0.20 U 时，扩增谱带模糊不清；浓度为0.20、0.25、0.28 U时，扩增谱带较弱，且数量相对较少；浓度为0.22 U时扩增条带较多且较亮，效果最好，故确定为最佳浓度。同时可以看出引物18257和18297的条带较为清晰而且数量较多，筛选出效果较好的引物为18257和18297。
2.2 dNTPs 浓度对 ISSR- PCR 反应的影响 图2表明，当浓度为0.3 mmol/L时，几乎无扩增产物；在0.4 mmol/L时，虽有扩增产物，但谱带较弱不易辨认；浓度为0.5～0.7 mmol/L时，均能扩增出清晰的谱带，但在0.6～0.7 mmol/L，扩增产物不稳定且有非特异性扩增；在0.6 mmol/L时，扩增谱带较弱或一些大的片段扩增缺失。考虑到结果的稳定性和减少试验成本，选用0.5 mmol/L 的dNTPs浓度，在此浓度下，扩增产物稳定、重复性强。同时对引物18262、18265、18266、18268和18269进行筛选，得出18265和18269扩增效果较好。
2.5 台兰优化体系的建立 通过对以上各种影响因素的分析优化，建立了反应稳定、重复性好的台兰ISSR-PCR 反应体系：在25 μl 反应体系中含2.5 μl 10×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，0.22 U Taq DNA 聚合酶，100 ng模板 DNA，双蒸水15.78 μl。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火（退火温度随引物不同而定，根据各引物的Tm值略低1～2 ℃）30 s，72 ℃延伸50 s，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
为了检测优化的效果，试验利用建立的优化体系，选用UBC822引物，在复性温度为50 ℃条件下，对12个筛选的引物进行批量扩增。图5表明，优化后的反应体系是比较理想的。
3 结论与讨论
3.1 ISSR 反应体系主要成分对ISSR-PCR反应稳定性的影响 ISSR是基于PCR反应的一种分子标记技术，具有DNA用量少、操作简单、快速灵敏、成本低等优点[6]，但ISSR-PCR扩增反应容易受许多因素的影响，如：Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度、dNTPs用量、DNA模板的浓度和纯度等，而且这些因素之间存在相互作用。因此，不同物种的最佳扩增条件各有不同，为确保 ISSR 分析结果的可靠性和重复性，获得较高的 ISSR-PCR扩增谱带，提高分析的准确性，针对不同物种相应的反应体系中各种影响因子进行优化，筛选出最适宜的ISSR-PCR扩增反应条件非常重要。
在ISSR-PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶的用量直接决定着实验的成功与否，量多不仅增加试验成本而且容易产生非特异性扩增产物；量少则会使酶过早地消耗完，产物合成效率低[7]。试验中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U时条带数量少且比较暗，用量多于0.22 U时条带虽然没有减少，但是出现了非特异性扩增产物，结果表明0.22 U是台兰ISSR-PCR反应的最佳条件。
dNTPs是ISSR-PCR反应的原料，通常dNTPs浓度范围为0.02～0.20 mmol/L[8]。dNTPs为Taq DNA聚合酶提供底物，使产物得以延伸。当dNTPs浓度过高，则导致Taq DNA聚合酶的错误掺入，会导致PCR错配，从而使扩增出现非特异性扩增，影响扩增的准确性；浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因过早的消耗而使产物单链化，影响扩增效果[9]。试验中dNTPs浓度为0.3和0.4 mmol/L时，因浓度太低而扩增产物过少，浓度为0.5、0.6和0.7 mmol/L时都有较多扩增产物，但后两者非特异性扩增相对较多，结果表明0.5 mmol/L为dNTPs最佳浓度。
Mg2+浓度是影响ISSR-PCR结果的一个重要因素，Mg2+浓度不仅影响Taq酶的活性[10]，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物结合，影响引物与模板的合效率、模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成[11]。试验中Mg2+浓度对反应无明显影响，所设置的几个浓度都有较多扩增产物，但浓度为2.0 mmol/L时条带较亮，结果表明2.0 mmol/L为Mg2+ 最佳浓度。
DNA模板浓度也是影响ISSR-PCR扩增效果的因素之一，浓度过低，扩增产物不稳定或无扩增产物；浓度过高，又会相应增加非特异性产物的扩增。最佳的模板浓度范围取决于研究的物种和模板纯度，在DNA模板不纯的情况下，宁可使用有效浓度范围内的最低浓度，使抑制Taq DNA 聚合酶的影响降到最小。试验中随着DNA模板浓度升高，扩增产物也相应增加，但同时非特异性产物也在增加，因此，考虑到稳定性和节约成本，试验采用的最佳DNA模板浓度为100 ng/L。