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摘要：中药中的有效成分绝大多数来源于植物的次生代谢的天然产物，而许多有效天然产物都来源于珍贵药材。人们可以通过合成生物学的途径对表达有效产物的基因进行挖掘，然后对其进行设计和标准化，通过在底盘细胞中进行装配，可以重建细胞的代谢途径，使之生产单一的目标产物。且合成生物学最大的特点就是工程化，将传统的种植提取转变为微生物发酵，进行大规模生产。
关键词：合成生物学 天然产物 微生物发酵
大多数天然产物来源于植物的次生代谢途径。在生物体内，初生代谢产物作为底物，再经复杂的体内化学反应生成了各种不同的天然產物。如萜类化合物的生物合成，它们均是由初级代谢产物IPP/DMAPP等前体经过一系列体内催化得到。早在2006年，美国加州大学伯克利分校就人工构建了酵母菌的代谢途径并成功合成了青蒿素的前体—青蒿酸，充分证实了合成生物学方法的可行性和巨大的潜在价值。下面简单阐述中药天然产物的合成途径：
一、 對中药药用成分次生代谢途径关键酶基因的筛选与克隆
得益于高通量基因测序技术的快速发展，目前人类已经可以实现对自然界任一物种进行基因测序并获得其完整基因组信息。与此同时，自然界生物的基因库信息日趋完整，人们将资料共享，也使得工作进展更加顺利。人们可以通过对比前后两种物质的结构，判断其缺少哪些化学基团，并推断其由什么酶系进行催化，再通过寻找其基因家族逐个进行转化实验直到有目标产物的生成。确定下来催化基因后，只需提取其RNA并进行反转录获得cDNA，再由确定下来的基因设计PCR引物，即可对催化基因进行克隆。
二、 次生代谢途径的解析
有机化学合成历史悠久，积累了丰富的物质化学结构及其合成过程经验。人们现在可以在有机化学书本上找到许多物质的化学合成途径。与中药天然产物合成密切相关的途径主要有乙酸-丙二酸途径（脂肪酸类、酚类、醌类），甲戊二氢酸途径（萜类、甾体化合物），莽草酸途径（苯丙素类、木质素类、香豆素类），氨基酸途径（生物碱），复合途径（查尔酮类、二氢黄酮类）。
三、 生物元件的改造与标准化
生物元件主要有三种类型：
① 基因表达的调控元件：启动子、终止子、核糖体结合位点、核糖开关等；
② DNA序列及质粒载体骨架序列；
③ 蛋白质结构域和蛋白质编码序列。
如今人们已经构建了丰富的生物元件库，如Igem registry。目前实现了强度跨度大，梯度密集的元件库的构建，且其强度可以由软件进行预测，为后续生物合成途径的代谢流平衡优化与复杂遗传环路的设计提供了坚实的保障。
四、 底盘细胞的设计与构建
为使细胞能够专一地生产目标产物，人们需要对微生物的基因进行改造，即敲除掉大部分对表达产物无关的基因，留下的基因使其仅仅能够维持自身基础的生命代谢与合成目标产物。底盘细胞的设计同时遵守两种设计思路，一种是“自上而下”的改造，即通过敲除的方法减少其基因组，实现最小基因组的装配；另一种思路则是“自下而上”的设计，通过预测生物合成所需要的基因进行完整基因组的设计。目前大肠杆菌、啤酒酵母、链霉菌及枯草芽孢杆菌已被证明是非常具有潜力的异源合成细胞。但在目前技术条件下，不同来源的基因还无法与宿主基因直接整合表达，往往需要进行表达调控原件替换、密码子优化等操作来消除种属差异。
五、代谢途径的装配与集成
主要包括两个方面：基因组装与基因组编辑
基因组装目前使用最广泛的方法是GIBSON等温一步法：需要一个线性化的载体和若干个PCR产物，在相邻两个DNA片段之间有20-40bp的重叠区。在反应阶段，T5外切酶将DNA5’端序列消化，形成了3’突出的粘端，然后再50℃下使得T5外切酶失活的同时，片段之间的重叠区退火连接，最后在phusion聚合酶的作用下补平片段间的间隔区，利用Taq DNA连接酶连接DNA缺刻。
基因组编辑技术目前最普遍的莫过于CPISPR-CAS9/CRISPR-CFP1，下面讲讲CRISPR-CAS9：
CPISPR：规律成簇间隔短回文重复，是细菌面对噬菌体侵染的一种自我免疫机制。主要分为三个阶段：
① 获取侵染的DNA序列并插入到CPISPR基因座的重复序列中；
② CAS蛋白表达，含spacer的CRISPR序列转录为前体crRNA，接着加工成成熟的crRNA，在typeII中，非编码的traRNA与crRNA的重复序列结合；
③ CAS蛋白在crRNA的介导下识别指定靶标序列并切割。
CPISPR-CAS9由sgRNA（traRNA与crRNA结合）引导与特定DNA结合，特定DNA上必须含有PAM序列（NGG），DNA被CAS9蛋白切割后双链断裂，引发体内两套修复系统的修复，一种是错误倾向的非同源末端连接修复（NHEJ），一种是精确的同源重组修复（HR）（需加入一段供体DNA作为模板）。通过引入多个sgRNA，CAS9可以同时切割多个位点，可应用于大规模的染色体重排。
六、 药用活性成分的异源合成与结构鉴定
典型例子就是青蒿酸的合成、紫杉二烯的生物合成。
在大肠杆菌内，IPP/DMAPP不是通过MVP途径获得的，敲除DXP还原酶基因，抑制其本身的非甲羟戊酸途径，然后将酵母的甲羟戊酸途径及优化密码子的紫穗槐二烯合酶（ADS）基因转入大肠杆菌体内，诱导其产生紫穗槐二烯。最后将源于青蒿的细胞色素P450单加氧酶基因导入催化其产生青蒿酸。
七、 代谢途径的优化与改造
a） 密码子偏好性优化；
b） 启动子强弱调节；
c） 代谢支路抑制。
八、 目标产物产量提高
中药类目标产物主要有苯丙素类、黄酮类、萜类、生物碱、甾体。
根据分离物质的极性不同，我们可以采用柱色谱进行分离，如硅胶柱色谱、大孔吸附树脂柱色谱等，还可以通过HPLC、紫外分光光度法、薄层硅胶层析等方法鉴定物质的种类，测定其含量等。
九、 总结与展望
随着合成生物学技术的不断发展，底盘细胞的不断完善及基因编辑技术的不断改进，用微生物进行天然产物的合成必将会有一个光明的前景。
参考文献：
【1】 李诗渊，赵国屏，王金。合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑。[J]生物工程学报，2017，33（3）：343-360.
【2】 卢志国，王建峰，蒙海林，熊智强，王勇。合成生物学与天然产物开发。[J]生命科学，1004-0374（2011）09-0900-12.
【3】 赵鹏，王霞，李炳志，乘景胜，元进英。合成生物学中的DNA组装技术。[J]生命科学，1004-0374（2013）10-0983-10.
关键词：合成生物学 天然产物 微生物发酵
大多数天然产物来源于植物的次生代谢途径。在生物体内，初生代谢产物作为底物，再经复杂的体内化学反应生成了各种不同的天然產物。如萜类化合物的生物合成，它们均是由初级代谢产物IPP/DMAPP等前体经过一系列体内催化得到。早在2006年，美国加州大学伯克利分校就人工构建了酵母菌的代谢途径并成功合成了青蒿素的前体—青蒿酸，充分证实了合成生物学方法的可行性和巨大的潜在价值。下面简单阐述中药天然产物的合成途径：
一、 對中药药用成分次生代谢途径关键酶基因的筛选与克隆
得益于高通量基因测序技术的快速发展，目前人类已经可以实现对自然界任一物种进行基因测序并获得其完整基因组信息。与此同时，自然界生物的基因库信息日趋完整，人们将资料共享，也使得工作进展更加顺利。人们可以通过对比前后两种物质的结构，判断其缺少哪些化学基团，并推断其由什么酶系进行催化，再通过寻找其基因家族逐个进行转化实验直到有目标产物的生成。确定下来催化基因后，只需提取其RNA并进行反转录获得cDNA，再由确定下来的基因设计PCR引物，即可对催化基因进行克隆。
二、 次生代谢途径的解析
有机化学合成历史悠久，积累了丰富的物质化学结构及其合成过程经验。人们现在可以在有机化学书本上找到许多物质的化学合成途径。与中药天然产物合成密切相关的途径主要有乙酸-丙二酸途径（脂肪酸类、酚类、醌类），甲戊二氢酸途径（萜类、甾体化合物），莽草酸途径（苯丙素类、木质素类、香豆素类），氨基酸途径（生物碱），复合途径（查尔酮类、二氢黄酮类）。
三、 生物元件的改造与标准化
生物元件主要有三种类型：
① 基因表达的调控元件：启动子、终止子、核糖体结合位点、核糖开关等；
② DNA序列及质粒载体骨架序列；
③ 蛋白质结构域和蛋白质编码序列。
如今人们已经构建了丰富的生物元件库，如Igem registry。目前实现了强度跨度大，梯度密集的元件库的构建，且其强度可以由软件进行预测，为后续生物合成途径的代谢流平衡优化与复杂遗传环路的设计提供了坚实的保障。
四、 底盘细胞的设计与构建
为使细胞能够专一地生产目标产物，人们需要对微生物的基因进行改造，即敲除掉大部分对表达产物无关的基因，留下的基因使其仅仅能够维持自身基础的生命代谢与合成目标产物。底盘细胞的设计同时遵守两种设计思路，一种是“自上而下”的改造，即通过敲除的方法减少其基因组，实现最小基因组的装配；另一种思路则是“自下而上”的设计，通过预测生物合成所需要的基因进行完整基因组的设计。目前大肠杆菌、啤酒酵母、链霉菌及枯草芽孢杆菌已被证明是非常具有潜力的异源合成细胞。但在目前技术条件下，不同来源的基因还无法与宿主基因直接整合表达，往往需要进行表达调控原件替换、密码子优化等操作来消除种属差异。
五、代谢途径的装配与集成
主要包括两个方面：基因组装与基因组编辑
基因组装目前使用最广泛的方法是GIBSON等温一步法：需要一个线性化的载体和若干个PCR产物，在相邻两个DNA片段之间有20-40bp的重叠区。在反应阶段，T5外切酶将DNA5’端序列消化，形成了3’突出的粘端，然后再50℃下使得T5外切酶失活的同时，片段之间的重叠区退火连接，最后在phusion聚合酶的作用下补平片段间的间隔区，利用Taq DNA连接酶连接DNA缺刻。
基因组编辑技术目前最普遍的莫过于CPISPR-CAS9/CRISPR-CFP1，下面讲讲CRISPR-CAS9：
CPISPR：规律成簇间隔短回文重复，是细菌面对噬菌体侵染的一种自我免疫机制。主要分为三个阶段：
① 获取侵染的DNA序列并插入到CPISPR基因座的重复序列中；
② CAS蛋白表达，含spacer的CRISPR序列转录为前体crRNA，接着加工成成熟的crRNA，在typeII中，非编码的traRNA与crRNA的重复序列结合；
③ CAS蛋白在crRNA的介导下识别指定靶标序列并切割。
CPISPR-CAS9由sgRNA（traRNA与crRNA结合）引导与特定DNA结合，特定DNA上必须含有PAM序列（NGG），DNA被CAS9蛋白切割后双链断裂，引发体内两套修复系统的修复，一种是错误倾向的非同源末端连接修复（NHEJ），一种是精确的同源重组修复（HR）（需加入一段供体DNA作为模板）。通过引入多个sgRNA，CAS9可以同时切割多个位点，可应用于大规模的染色体重排。
六、 药用活性成分的异源合成与结构鉴定
典型例子就是青蒿酸的合成、紫杉二烯的生物合成。
在大肠杆菌内，IPP/DMAPP不是通过MVP途径获得的，敲除DXP还原酶基因，抑制其本身的非甲羟戊酸途径，然后将酵母的甲羟戊酸途径及优化密码子的紫穗槐二烯合酶（ADS）基因转入大肠杆菌体内，诱导其产生紫穗槐二烯。最后将源于青蒿的细胞色素P450单加氧酶基因导入催化其产生青蒿酸。
七、 代谢途径的优化与改造
a） 密码子偏好性优化；
b） 启动子强弱调节；
c） 代谢支路抑制。
八、 目标产物产量提高
中药类目标产物主要有苯丙素类、黄酮类、萜类、生物碱、甾体。
根据分离物质的极性不同，我们可以采用柱色谱进行分离，如硅胶柱色谱、大孔吸附树脂柱色谱等，还可以通过HPLC、紫外分光光度法、薄层硅胶层析等方法鉴定物质的种类，测定其含量等。
九、 总结与展望
随着合成生物学技术的不断发展，底盘细胞的不断完善及基因编辑技术的不断改进，用微生物进行天然产物的合成必将会有一个光明的前景。
参考文献：
【1】 李诗渊，赵国屏，王金。合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑。[J]生物工程学报，2017，33（3）：343-360.
【2】 卢志国，王建峰，蒙海林，熊智强，王勇。合成生物学与天然产物开发。[J]生命科学，1004-0374（2011）09-0900-12.
【3】 赵鹏，王霞，李炳志，乘景胜，元进英。合成生物学中的DNA组装技术。[J]生命科学，1004-0374（2013）10-0983-10.