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【摘要】 目的：比较新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸序列之间的差异，分析HA、NA蛋白可能的抗原性细胞表位。方法：从GenBank中选取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分离株并下载各株HA、NA的氨基酸序列；使用Clustal X和MEGA 2.0软件对氨基酸序列的进行进化树分析；用Protean软件预测HA、NA蛋白的B细胞表位；用NetMHCⅡ 2.2预测T细胞抗原表位。结果：世界范围的毒株之间氨基酸序列相对保守，HA及NA均只有少数位点的变异，HA蛋白氨基酸序列之间较NA蛋白氨基酸序列之间变异较大；预测HA蛋白具有8个B细胞表位和10个T细胞表位；NA蛋白有12个B细胞表位和7个T细胞表位。结论：HA、NA蛋白的少数区域抗原性相对比较稳定，可以作为检测以及疫苗研究的靶区域。
【关键词】 H1N1流感病毒； 抗原表位； 血凝素； 神经氨酸酶
2009年4月，在美国首次报道了两例感染新型甲型H1N1流感病毒患者[1]，同时在墨西哥出现了呼吸道感染的流行[2]。美国爆发的甲型H1N1流感迅速在北美洲地区蔓延，并很快波及亚洲、欧洲。新型甲型H1N1流感病毒是由禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的基因片段间的变异或重组产生的[3]，已经引起世界性的大流行。
甲型H1N1流感能不断引起流行是由于其抗原性不断发生漂移所致[4]，其中最重要是血凝素（hemagglutinin，HA） 和神经氨酸酶 （neuraminidase，NA） 的变异[5]。血凝素是流感病毒最重要的蛋白，它的裂解性、受体特异性和糖基化是决定流感病毒感染性和致病性的重要因素。神经氨酸酶是病毒囊膜表面的另一种重要的糖蛋白，在决定病毒毒力和宿主特异性方面也具有重要作用，与HA共为流感病毒亚型分型的主要依据，NA同时也是抗流感病毒的重要作用靶点[6]。目前，国内虽然已经开发了H1N1流感疫苗并接种了2000多万人，但是，接种所致的不良反应事例的出现同样给健康的人们带来了灾难。有针对性地改造毒素的相应蛋白、获得更为安全有效的疫苗成为解决问题的关键，而解析甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白的抗原性表位成为关键的突破口。
本研究分析了甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白抗原性变化的情况，并对其可能的抗原性表位进行了分析预测，为新型甲型流感疫苗的制备提供依据，以便更有效及时地控制甲型流感的传播。
1 材料与方法
1.1 新型甲型H1N1流感病毒株HA和NA基因序列与氨基酸序列 从NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html）网站下载新近公布的新发甲型H1N1流感病毒的核酸序列与氨基酸序列。从不同国家和地区随机挑选28株新型甲型H1N1流感病毒株来进行接下来的序列比较和抗原性分析。
1.2 新型甲型H1N1流感病毒的细胞抗原表位预测 用Clustal X软件分别对28例HA、NA氨基酸序列进行多序列比较，然后使用MEGA 2.0的邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建进化树，分析彼此之间序列的变异大小。对比序列比对分析结果，选取其中代表性的序列作为基准株，用Protean软件对基准序列的亲水性、表面可能性、抗原指数进行综合分析，分析各指数值得到B细胞抗原表位预测结果；使用NetMHCⅡ 2.2在线表位预测服务器，选定服务器包含的所有MHC classⅡ等位基因，以9个连续氨基酸为测定单位，根据各序列与MHC classⅡ等位基因的亲和能力不同，预测出其可能的T细胞抗原表位。
2 结果
2.1 新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸比较 用MEGA 2.0进行进化树分析，所得结果见图1、图2。从图1和2可以看出，28例HA以及NA氨基酸序列可以分为两个大的族群，通过对这两个族群的氨基酸序列进行分析发现，HA氨基酸序列按220位氨基酸为苏氨酸或者丝氨酸分为两个族群；NA氨基酸序列按106位异亮氨酸突变成缬氨酸、248位天冬氨酸突变成天冬氨酰分成两个大的族群；分别选取两种蛋白的两个族群中较有代表性的HA氨基酸序列CY046475与CY044869和NA氨基酸序列CY046477与GQ149691为基准序列以便进行下一步的细胞抗原性表位预测。
图1 28例甲型流感病毒H1N1 HA氨基酸序列进化树
2.2 Protean软件分析基准株HA、NA蛋白B细胞抗原性特征 用Plot-Kyte-Doolittle亲水性[7]、Plot-Emini表面可能性[8]、Jameson-Wolf抗原指数[9]三参数综合考虑预测方案进行B细胞表位预测，HA氨基酸序列CY046475与CY044869的B细胞表位预测结果并没有明显差别，同样，NA氨基酸序列CY046477与GQ149691的B细胞表位预测结果也没有
注：进化树后的名称为GeneBank的登录号
图2 28例甲型流感病毒H1N1 NA氨基酸序列进化树
注：进化树后的名称为GeneBank的登录号
明显差别，因此，只选取HA氨基酸序列CY046475和NA氨基酸序列CY046477的结果列出。对各个参数进行综合分析，发现在HA蛋白中50-55、110-120、137-141、175-179、208-222、361-369、457-460、478-500各项指数均较高，提示可能是抗原性表位，见图3。综合各参数分析，发现在NA蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425各项指数均较高，提示为抗原性表位，见图4。
图3 HA蛋白 （CY046475） B细胞表位分析结果 图4 NA蛋白 （CY046477） B细胞表位分析结果
2.3 NetMHCⅡ 2.2软件分析基准株HA、NA蛋白T细胞抗原性特征 使用NetMHCⅡ 2.2在线T细胞抗原表位预测服务器分析了基准株HA、NA蛋白T细胞抗原性表位，发现HA蛋白中8-16、41-49、61-69、96-104、155-169、215-223、259-267、309-331、346-354、532-542氨基酸区段抗原值较高，见图5；NA蛋白中32-40、74-85、132-140、155-163、177-185、256-264、351-359氨基酸区域抗原值较高，见图6，可能为T细胞抗原性表位。
图5 HA蛋白 （CY046475） T细胞表位分析结果
注：纵坐标的分值表示NetMHCⅡ 2.2软件预测的9氨基酸滑动肽与各MHC class Ⅱ等位基因的亲和力大小
图6 NA蛋白 （CY046477） T细胞表位分析结果
注：纵坐标的分值表示NetMHCⅡ 2.2软件预测的9氨基酸滑动肽与各MHC class Ⅱ等位基因的亲和力大小
3 讨论
甲型（A）流感病毒（influenza virus A）基因组含有8个RNA片段[10]，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚合酶；第4个节段负责编码血凝素（hemagglutinin， HA）蛋白；第5个节段负责编码核蛋白（nucleoprotein， NP）；第6个节段编码的是神经氨酸酶（neuraminidase， NA）；第7个节段编码基质蛋白（matrix protein， MP）；第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白，这种蛋白的其他功能尚不得而知。血凝素蛋白和神经氨酸酶被认为是最重要的免疫原性位点[11]。
经过对选自世界各国不同流感病毒株的HA、NA蛋白序列进行Clustal X分析，发现不同株之间氨基酸序列相对保守。HA蛋白最具特征性的变异为220位氨基酸的差别，28株中有15株为丝氨酸和13株为苏氨酸。对28例NA蛋白中有8例同时发生了106位异亮氨酸突变成缬氨酸、248位天冬氨酸突变成天冬氨酰。总体上来看，HA蛋白的变异性相对于NA蛋白较大。
利用Protean软件对基准株的HA、NA抗原表位进行预测，联合使用Kyte-Doolittle的亲水性方案，Plot-Emini的蛋白质表面可能性方案及Jameson-Wolf的抗原指数方案进行综合分析，发现HA蛋白有8段序列，NA蛋白有12段序列是可能的B细胞抗原表位。对220位氨基酸为苏氨酸的HA蛋白和106位氨基酸为缬氨酸、248位为天冬氨酰的NA蛋白与未发生相应变异的蛋白序列进行比较，发现变异位点并不影响HA、NA蛋白的B细胞表位特征。利用NetMHCⅡ 2.2软件分析T细胞抗原表位也同样发现，上述变异位点并不影响HA、NA蛋白的T细胞表位特征。根据以上分析，提示新型甲型H1N1流感病毒关键蛋白HA、NA的一些区域抗原性相对比较稳定，可以作为检测以及疫苗研发的靶区域。
随着计算机技术的不断发展，细胞抗原性表位预测方法也得到了很大的进步与广泛的应用，如表位疫苗的设计、新的诊断试剂开发等。但是细胞抗原性表位预测仍然不够完善。目前，几乎所有的细胞抗原性表位预测的算法都是预测连续氨基酸组成的线性表位，而较少涉及构象性表位的研究。本研究仅是对新型H1N1流感病毒的HA和NA蛋白的细胞抗原性表位进行初步筛选，预测结果需要进一步用实验结果来证实。
参考文献
[1] Centers for Disease Control and Prevention. Update： swine influenza A （H1N1） infections-California and Texas， April 2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（16）：435-437.
[2] Centers for Disease Control and Prevention. Update： novel influenza A （H1N1） virus infection - Mexico， March-May，2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（21）：585-589.
[3] Zimmer S M and D S Burke.Historical perspective-Emergence of influenza A （H1N1） viruses[J].N Engl J Med，2009，361（3）：279-285.
[4] Hajjar L A， Schout D， Galas F R， et al. Guidelines on management of human infection with the novel virus influenza A （H1N1）-a report from the Hospital das Clinicas of the University of Sao Paulo[J].Clinics （Sao Paulo），2009，64（10）：1015-1024.
[5] Machala M K and L B Brydak.Various sides of influenza， part I-structure，replication，changeability of influenza viruses， clinical course of the disease， immunological response and laboratory diagnostics[J].Pol Merkur Lekarski，2006，21（123）：270-276. [6] Su C Y， Wang S Y， Shie J J， et al. In vitro evaluation of neuraminidase inhibitors using the neuraminidase-dependent release assay of hemagglutinin-pseudotyped viruses[J].Antiviral Res，2008，79（3）：199-205.
[7] Kyte J and Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.
[8] Karplus P A and Schulz G E.Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from refined enzyme：substrate crystal structures at 2 A resolution[J].J Mol Biol，1989，210（1）：163-180.
[9] Jameson B A and Wolf H.The antigenic index： a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.
[10] Nicholson K G，Wood J M，Zambon M.Influenza[J].Lancet，2003，362（9397）：1733-1745.
[11] Kash J C， Basler C F， García-Sastre A， et al. Global host immune response： pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza viruses expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus[J].J Virol， 2004，78（17）：9499-9511.
（收稿日期：2013-03-28） （本文编辑：连胜利）
【关键词】 H1N1流感病毒； 抗原表位； 血凝素； 神经氨酸酶
2009年4月，在美国首次报道了两例感染新型甲型H1N1流感病毒患者[1]，同时在墨西哥出现了呼吸道感染的流行[2]。美国爆发的甲型H1N1流感迅速在北美洲地区蔓延，并很快波及亚洲、欧洲。新型甲型H1N1流感病毒是由禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的基因片段间的变异或重组产生的[3]，已经引起世界性的大流行。
甲型H1N1流感能不断引起流行是由于其抗原性不断发生漂移所致[4]，其中最重要是血凝素（hemagglutinin，HA） 和神经氨酸酶 （neuraminidase，NA） 的变异[5]。血凝素是流感病毒最重要的蛋白，它的裂解性、受体特异性和糖基化是决定流感病毒感染性和致病性的重要因素。神经氨酸酶是病毒囊膜表面的另一种重要的糖蛋白，在决定病毒毒力和宿主特异性方面也具有重要作用，与HA共为流感病毒亚型分型的主要依据，NA同时也是抗流感病毒的重要作用靶点[6]。目前，国内虽然已经开发了H1N1流感疫苗并接种了2000多万人，但是，接种所致的不良反应事例的出现同样给健康的人们带来了灾难。有针对性地改造毒素的相应蛋白、获得更为安全有效的疫苗成为解决问题的关键，而解析甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白的抗原性表位成为关键的突破口。
本研究分析了甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白抗原性变化的情况，并对其可能的抗原性表位进行了分析预测，为新型甲型流感疫苗的制备提供依据，以便更有效及时地控制甲型流感的传播。
1 材料与方法
1.1 新型甲型H1N1流感病毒株HA和NA基因序列与氨基酸序列 从NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html）网站下载新近公布的新发甲型H1N1流感病毒的核酸序列与氨基酸序列。从不同国家和地区随机挑选28株新型甲型H1N1流感病毒株来进行接下来的序列比较和抗原性分析。
1.2 新型甲型H1N1流感病毒的细胞抗原表位预测 用Clustal X软件分别对28例HA、NA氨基酸序列进行多序列比较，然后使用MEGA 2.0的邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建进化树，分析彼此之间序列的变异大小。对比序列比对分析结果，选取其中代表性的序列作为基准株，用Protean软件对基准序列的亲水性、表面可能性、抗原指数进行综合分析，分析各指数值得到B细胞抗原表位预测结果；使用NetMHCⅡ 2.2在线表位预测服务器，选定服务器包含的所有MHC classⅡ等位基因，以9个连续氨基酸为测定单位，根据各序列与MHC classⅡ等位基因的亲和能力不同，预测出其可能的T细胞抗原表位。
2 结果
2.1 新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸比较 用MEGA 2.0进行进化树分析，所得结果见图1、图2。从图1和2可以看出，28例HA以及NA氨基酸序列可以分为两个大的族群，通过对这两个族群的氨基酸序列进行分析发现，HA氨基酸序列按220位氨基酸为苏氨酸或者丝氨酸分为两个族群；NA氨基酸序列按106位异亮氨酸突变成缬氨酸、248位天冬氨酸突变成天冬氨酰分成两个大的族群；分别选取两种蛋白的两个族群中较有代表性的HA氨基酸序列CY046475与CY044869和NA氨基酸序列CY046477与GQ149691为基准序列以便进行下一步的细胞抗原性表位预测。
图1 28例甲型流感病毒H1N1 HA氨基酸序列进化树
2.2 Protean软件分析基准株HA、NA蛋白B细胞抗原性特征 用Plot-Kyte-Doolittle亲水性[7]、Plot-Emini表面可能性[8]、Jameson-Wolf抗原指数[9]三参数综合考虑预测方案进行B细胞表位预测，HA氨基酸序列CY046475与CY044869的B细胞表位预测结果并没有明显差别，同样，NA氨基酸序列CY046477与GQ149691的B细胞表位预测结果也没有
注：进化树后的名称为GeneBank的登录号
图2 28例甲型流感病毒H1N1 NA氨基酸序列进化树
注：进化树后的名称为GeneBank的登录号
明显差别，因此，只选取HA氨基酸序列CY046475和NA氨基酸序列CY046477的结果列出。对各个参数进行综合分析，发现在HA蛋白中50-55、110-120、137-141、175-179、208-222、361-369、457-460、478-500各项指数均较高，提示可能是抗原性表位，见图3。综合各参数分析，发现在NA蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425各项指数均较高，提示为抗原性表位，见图4。
图3 HA蛋白 （CY046475） B细胞表位分析结果 图4 NA蛋白 （CY046477） B细胞表位分析结果
2.3 NetMHCⅡ 2.2软件分析基准株HA、NA蛋白T细胞抗原性特征 使用NetMHCⅡ 2.2在线T细胞抗原表位预测服务器分析了基准株HA、NA蛋白T细胞抗原性表位，发现HA蛋白中8-16、41-49、61-69、96-104、155-169、215-223、259-267、309-331、346-354、532-542氨基酸区段抗原值较高，见图5；NA蛋白中32-40、74-85、132-140、155-163、177-185、256-264、351-359氨基酸区域抗原值较高，见图6，可能为T细胞抗原性表位。
图5 HA蛋白 （CY046475） T细胞表位分析结果
注：纵坐标的分值表示NetMHCⅡ 2.2软件预测的9氨基酸滑动肽与各MHC class Ⅱ等位基因的亲和力大小
图6 NA蛋白 （CY046477） T细胞表位分析结果
注：纵坐标的分值表示NetMHCⅡ 2.2软件预测的9氨基酸滑动肽与各MHC class Ⅱ等位基因的亲和力大小
3 讨论
甲型（A）流感病毒（influenza virus A）基因组含有8个RNA片段[10]，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚合酶；第4个节段负责编码血凝素（hemagglutinin， HA）蛋白；第5个节段负责编码核蛋白（nucleoprotein， NP）；第6个节段编码的是神经氨酸酶（neuraminidase， NA）；第7个节段编码基质蛋白（matrix protein， MP）；第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白，这种蛋白的其他功能尚不得而知。血凝素蛋白和神经氨酸酶被认为是最重要的免疫原性位点[11]。
经过对选自世界各国不同流感病毒株的HA、NA蛋白序列进行Clustal X分析，发现不同株之间氨基酸序列相对保守。HA蛋白最具特征性的变异为220位氨基酸的差别，28株中有15株为丝氨酸和13株为苏氨酸。对28例NA蛋白中有8例同时发生了106位异亮氨酸突变成缬氨酸、248位天冬氨酸突变成天冬氨酰。总体上来看，HA蛋白的变异性相对于NA蛋白较大。
利用Protean软件对基准株的HA、NA抗原表位进行预测，联合使用Kyte-Doolittle的亲水性方案，Plot-Emini的蛋白质表面可能性方案及Jameson-Wolf的抗原指数方案进行综合分析，发现HA蛋白有8段序列，NA蛋白有12段序列是可能的B细胞抗原表位。对220位氨基酸为苏氨酸的HA蛋白和106位氨基酸为缬氨酸、248位为天冬氨酰的NA蛋白与未发生相应变异的蛋白序列进行比较，发现变异位点并不影响HA、NA蛋白的B细胞表位特征。利用NetMHCⅡ 2.2软件分析T细胞抗原表位也同样发现，上述变异位点并不影响HA、NA蛋白的T细胞表位特征。根据以上分析，提示新型甲型H1N1流感病毒关键蛋白HA、NA的一些区域抗原性相对比较稳定，可以作为检测以及疫苗研发的靶区域。
随着计算机技术的不断发展，细胞抗原性表位预测方法也得到了很大的进步与广泛的应用，如表位疫苗的设计、新的诊断试剂开发等。但是细胞抗原性表位预测仍然不够完善。目前，几乎所有的细胞抗原性表位预测的算法都是预测连续氨基酸组成的线性表位，而较少涉及构象性表位的研究。本研究仅是对新型H1N1流感病毒的HA和NA蛋白的细胞抗原性表位进行初步筛选，预测结果需要进一步用实验结果来证实。
参考文献
[1] Centers for Disease Control and Prevention. Update： swine influenza A （H1N1） infections-California and Texas， April 2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（16）：435-437.
[2] Centers for Disease Control and Prevention. Update： novel influenza A （H1N1） virus infection - Mexico， March-May，2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（21）：585-589.
[3] Zimmer S M and D S Burke.Historical perspective-Emergence of influenza A （H1N1） viruses[J].N Engl J Med，2009，361（3）：279-285.
[4] Hajjar L A， Schout D， Galas F R， et al. Guidelines on management of human infection with the novel virus influenza A （H1N1）-a report from the Hospital das Clinicas of the University of Sao Paulo[J].Clinics （Sao Paulo），2009，64（10）：1015-1024.
[5] Machala M K and L B Brydak.Various sides of influenza， part I-structure，replication，changeability of influenza viruses， clinical course of the disease， immunological response and laboratory diagnostics[J].Pol Merkur Lekarski，2006，21（123）：270-276. [6] Su C Y， Wang S Y， Shie J J， et al. In vitro evaluation of neuraminidase inhibitors using the neuraminidase-dependent release assay of hemagglutinin-pseudotyped viruses[J].Antiviral Res，2008，79（3）：199-205.
[7] Kyte J and Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.
[8] Karplus P A and Schulz G E.Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from refined enzyme：substrate crystal structures at 2 A resolution[J].J Mol Biol，1989，210（1）：163-180.
[9] Jameson B A and Wolf H.The antigenic index： a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.
[10] Nicholson K G，Wood J M，Zambon M.Influenza[J].Lancet，2003，362（9397）：1733-1745.
[11] Kash J C， Basler C F， García-Sastre A， et al. Global host immune response： pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza viruses expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus[J].J Virol， 2004，78（17）：9499-9511.
（收稿日期：2013-03-28） （本文编辑：连胜利）