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论文摘要 ：UFLC法能准确测定克林霉素磷酸酯含量，适用于工作量较大的检测项目如制剂含量、含量均匀度及溶出度等的快速测定；但对有关物质的分析，经简单方法转换建立的UFLC方法，杂质分离的数目少，部分杂质间的分离度变差，其分离特性不如常规的HPLC法。
主题词： 克林霉素磷酸酯 测定技术
中图分类号：TK417+.4
快速液相色谱（ultrafast liquid chromatography，UFLC）是一种新的快速分析技术，它与超高效液相色谱（ultraperformence liquid chromatography，UPLC）的最大区别是其不需要系统超高压（485～830bar），在略高于普通液相色谱压力极限（345bar）下即可实现高流速、高分辨率分析，适用于要求高通量、高效率的分析工作，在药物分析领域前景广阔。
一、仪器与试药
岛津液相色谱仪（LC20AT泵，SIL20AC自动进样器，SPDM20A检测器经改装适应快速分离，LC Solution色谱工作站）与Waters Alliance色谱分离单元（2690泵，996PDA监测器，Millinium 2.3色谱工作站）。克林霉素磷酸酯对照品（批号130486200502，含量79.0%），克林霉素对照品（批号130422200402，含量86.5%），林可霉素对照品（批号130432200407，含量86.2%）；克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液均由中国药品生物制品检定所提供。磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯，水为双蒸水，乙腈、甲醇为色谱纯。
二、方法与结果
1 、供试品溶液与对照品溶液的制备
（1）供试品溶液 取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液用流动相稀释成0.3mg/ml的溶液，分别称为溶液（A）和溶液（B）。另取上述两供试品溶液同法稀释成3.0mg/ml的溶液，作有关物质分析供试液。
（2）对照品溶液 分别取克林霉素磷酸酯、克林霉素和林可霉素对照品适量，精密称定；加流动相溶解定量稀释制成含上述三种对照品各约0.3mg/ml的混合溶液。
2、 实验方法
UFLC分析采用Waters XTerraTM MS C18杂化柱（50mm×4.6mm，2.5μm），常规HPLC分析采用Apollo C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱。流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲盐（85%磷酸调pH3.5）∶乙腈∶甲醇（700∶150∶150）（需用0.22μm滤膜过滤）；检测波长210nm；流速分别为1.5ml/min（UFLC）和1.0ml/min（常规HPLC）；柱温25℃；供试品浓度0.3mg/ml（含测），3.0mg/ml（有关物质）；进样体积分别为2μl（UFLC）和10μl（常规HPLC）。
3 、 结果
（1）色谱行为 取供试品溶液（A），分别用UFLC法和常规HPLC法进行测定，其典型的色谱图。
克林霉素磷酸酯在UFLC测定中的保留时间（tR）约4.3min，5～6min即可完成分析；在常规HPLC法中，主峰的tR约14.8min。UFLC法在测定时间上较HPLC法快4倍多，且主峰峰型对称，理论板数达7000左右，高于常规HPLC理论板数（约3000）。
（2）方法学验证
线性范围和最低检测限 精密称取克林霉素磷酸酯对照品约30mg，置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密吸取适量，用流动相稀释成0.1、0.3、0.6、1.0、1.5和3.0mg/ml的溶液，分别用UFLC法和常规HPLC法测定，记录色谱图。以克林霉素磷酸酯的峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），进行线性回归；另取0.1mg/ml的对照品溶液分别稀释成50.0、40.0、30.0、10.0、5.0和1.0μg/ml，同法测定；最低检测限（LOD）按信噪比为3计算，最低定量限（LOQ）按信噪比为10计算。
UFLC法常规HPLC法线性范围（mg/ml）0.01～2.50.01～2.0回归方程
Y=2.56908×105X-620.86
r=0.9999Y=7.0×106X
r=0.9954最低定量限（ng）60400最低检测限（ng）20100
精密度 取对照品溶液2μl注入高效相色谱仪，重复进样5次，RSD为0.41%。
重复性和溶液稳定性 取供试品溶液（A）2μl注入高效相色谱仪，重复进样5次，平均含量为104.5%，RSD为1.7%。另取供试品溶液（A）、（B）分别在室温放置24h后测定。24h后主峰峰面积减失百分率<2%，结果表明供试品溶液在24h内较稳定。
4 、 样品测定
分别取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液各8批，每批样品平行分成2份，分别用UFLC法和常规HPLC法测定，外标法计算含量。结果进行配对t检验。两方法测定克林霉素磷酸酯葡萄糖（氯化钠）注射液的含量结果无显著性差异。
5 、 有关物质测定
分别采用UFLC法和常规HPLC法测定，以主成分自身对照法计算有关物质。UFLC法与常规方法测得的有关物质典型色谱图。
UFLC法可检出7个杂质峰，2号峰似融合峰，4、5、6号峰间的分离度不好；常规HPLC法 两种克林霉素磷酸酯注射液的含测结果相近。
三、讨论
（1）UFLC方法的确定 本UFLC方法由标准方法经简单方法转换而来。由于UFLC液相系统的压力界于常压与超高压液相系统之间（345～485bar），色谱柱采用短、细粒径的ODS杂化柱，因此方法转换中对样品预处理方法、色谱流动相、流速和进样体积需要重点考虑。实验中采用0.22μm的滤膜过滤样品及流动相可以更有效除去杂质对系统及色谱柱的污染，保持系统的稳定。由于分析时间、柱分析效能及系统载压三方面因素彼此相互影响且相互制约，因此寻找适合三方面要求的最佳实验条件是实现快速分析的关键。本文根据色谱有关理论，对流速、进样体积进行了优化。考察流速在1.0～3.0ml/min范围内主峰的保留时间与系统压力变化的关系，发现当流速为1.5ml/min时，tR已提前至4min左右，继续增加流速虽然保留时间减小，但系统压力显著上升；流速为2.0ml/min时，系统压力已接近（485bar）。含量测定中，不同进样体积对主峰的拖尾因子（T）和理论板数（N）的影响。可见，1、2μl进样量测定的峰型对称、柱效较高；但当进样量减至1μl，虽然峰型和柱效较高，但结果准确性变差，连续进样的RSD>2%；增加进样量，色谱峰形逐渐变差，柱效下降；且过大进样量易造成色谱柱过载，影响分析的准确性和稳定性。
（2）UFLC分析的特点 比较UFLC法与常规HPLC法分析测定克林霉素磷酸酯含量及有关物质结果，发现UFLC法测定克林霉素磷酸酯不仅准确，而且比常规方法更快速、灵敏，特别适合于对克林霉素磷酸酯含量的快速测定，在工作量较大的检测项目如制剂含量、含量均匀度及溶出度等中应用，能有效提高工作效率。但实验也发现，经简单方法转换建立的UFLC方法的专属性、准确性均不如常规HPLC法，影响对杂质的定性及限度控制。快速分析利用色谱柱粒径细、柱短这一特点争取了分析时间，但同时也使得峰容量损失[4]。在对复杂样品的分析中，这种分析时间与分析效果间的矛盾更加明显。因此，如希望采用UFLC法分析复杂体系如药品的有关物质，一般不能通过简单的方法转换而实现，而应根据研究对象的特性及UFLC色谱柱的性质，通过深入的实验研究建立相应的分析方法。
主题词： 克林霉素磷酸酯 测定技术
中图分类号：TK417+.4
快速液相色谱（ultrafast liquid chromatography，UFLC）是一种新的快速分析技术，它与超高效液相色谱（ultraperformence liquid chromatography，UPLC）的最大区别是其不需要系统超高压（485～830bar），在略高于普通液相色谱压力极限（345bar）下即可实现高流速、高分辨率分析，适用于要求高通量、高效率的分析工作，在药物分析领域前景广阔。
一、仪器与试药
岛津液相色谱仪（LC20AT泵，SIL20AC自动进样器，SPDM20A检测器经改装适应快速分离，LC Solution色谱工作站）与Waters Alliance色谱分离单元（2690泵，996PDA监测器，Millinium 2.3色谱工作站）。克林霉素磷酸酯对照品（批号130486200502，含量79.0%），克林霉素对照品（批号130422200402，含量86.5%），林可霉素对照品（批号130432200407，含量86.2%）；克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液均由中国药品生物制品检定所提供。磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯，水为双蒸水，乙腈、甲醇为色谱纯。
二、方法与结果
1 、供试品溶液与对照品溶液的制备
（1）供试品溶液 取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液用流动相稀释成0.3mg/ml的溶液，分别称为溶液（A）和溶液（B）。另取上述两供试品溶液同法稀释成3.0mg/ml的溶液，作有关物质分析供试液。
（2）对照品溶液 分别取克林霉素磷酸酯、克林霉素和林可霉素对照品适量，精密称定；加流动相溶解定量稀释制成含上述三种对照品各约0.3mg/ml的混合溶液。
2、 实验方法
UFLC分析采用Waters XTerraTM MS C18杂化柱（50mm×4.6mm，2.5μm），常规HPLC分析采用Apollo C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱。流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲盐（85%磷酸调pH3.5）∶乙腈∶甲醇（700∶150∶150）（需用0.22μm滤膜过滤）；检测波长210nm；流速分别为1.5ml/min（UFLC）和1.0ml/min（常规HPLC）；柱温25℃；供试品浓度0.3mg/ml（含测），3.0mg/ml（有关物质）；进样体积分别为2μl（UFLC）和10μl（常规HPLC）。
3 、 结果
（1）色谱行为 取供试品溶液（A），分别用UFLC法和常规HPLC法进行测定，其典型的色谱图。
克林霉素磷酸酯在UFLC测定中的保留时间（tR）约4.3min，5～6min即可完成分析；在常规HPLC法中，主峰的tR约14.8min。UFLC法在测定时间上较HPLC法快4倍多，且主峰峰型对称，理论板数达7000左右，高于常规HPLC理论板数（约3000）。
（2）方法学验证
线性范围和最低检测限 精密称取克林霉素磷酸酯对照品约30mg，置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密吸取适量，用流动相稀释成0.1、0.3、0.6、1.0、1.5和3.0mg/ml的溶液，分别用UFLC法和常规HPLC法测定，记录色谱图。以克林霉素磷酸酯的峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），进行线性回归；另取0.1mg/ml的对照品溶液分别稀释成50.0、40.0、30.0、10.0、5.0和1.0μg/ml，同法测定；最低检测限（LOD）按信噪比为3计算，最低定量限（LOQ）按信噪比为10计算。
UFLC法常规HPLC法线性范围（mg/ml）0.01～2.50.01～2.0回归方程
Y=2.56908×105X-620.86
r=0.9999Y=7.0×106X
r=0.9954最低定量限（ng）60400最低检测限（ng）20100
精密度 取对照品溶液2μl注入高效相色谱仪，重复进样5次，RSD为0.41%。
重复性和溶液稳定性 取供试品溶液（A）2μl注入高效相色谱仪，重复进样5次，平均含量为104.5%，RSD为1.7%。另取供试品溶液（A）、（B）分别在室温放置24h后测定。24h后主峰峰面积减失百分率<2%，结果表明供试品溶液在24h内较稳定。
4 、 样品测定
分别取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液各8批，每批样品平行分成2份，分别用UFLC法和常规HPLC法测定，外标法计算含量。结果进行配对t检验。两方法测定克林霉素磷酸酯葡萄糖（氯化钠）注射液的含量结果无显著性差异。
5 、 有关物质测定
分别采用UFLC法和常规HPLC法测定，以主成分自身对照法计算有关物质。UFLC法与常规方法测得的有关物质典型色谱图。
UFLC法可检出7个杂质峰，2号峰似融合峰，4、5、6号峰间的分离度不好；常规HPLC法 两种克林霉素磷酸酯注射液的含测结果相近。
三、讨论
（1）UFLC方法的确定 本UFLC方法由标准方法经简单方法转换而来。由于UFLC液相系统的压力界于常压与超高压液相系统之间（345～485bar），色谱柱采用短、细粒径的ODS杂化柱，因此方法转换中对样品预处理方法、色谱流动相、流速和进样体积需要重点考虑。实验中采用0.22μm的滤膜过滤样品及流动相可以更有效除去杂质对系统及色谱柱的污染，保持系统的稳定。由于分析时间、柱分析效能及系统载压三方面因素彼此相互影响且相互制约，因此寻找适合三方面要求的最佳实验条件是实现快速分析的关键。本文根据色谱有关理论，对流速、进样体积进行了优化。考察流速在1.0～3.0ml/min范围内主峰的保留时间与系统压力变化的关系，发现当流速为1.5ml/min时，tR已提前至4min左右，继续增加流速虽然保留时间减小，但系统压力显著上升；流速为2.0ml/min时，系统压力已接近（485bar）。含量测定中，不同进样体积对主峰的拖尾因子（T）和理论板数（N）的影响。可见，1、2μl进样量测定的峰型对称、柱效较高；但当进样量减至1μl，虽然峰型和柱效较高，但结果准确性变差，连续进样的RSD>2%；增加进样量，色谱峰形逐渐变差，柱效下降；且过大进样量易造成色谱柱过载，影响分析的准确性和稳定性。
（2）UFLC分析的特点 比较UFLC法与常规HPLC法分析测定克林霉素磷酸酯含量及有关物质结果，发现UFLC法测定克林霉素磷酸酯不仅准确，而且比常规方法更快速、灵敏，特别适合于对克林霉素磷酸酯含量的快速测定，在工作量较大的检测项目如制剂含量、含量均匀度及溶出度等中应用，能有效提高工作效率。但实验也发现，经简单方法转换建立的UFLC方法的专属性、准确性均不如常规HPLC法，影响对杂质的定性及限度控制。快速分析利用色谱柱粒径细、柱短这一特点争取了分析时间，但同时也使得峰容量损失[4]。在对复杂样品的分析中，这种分析时间与分析效果间的矛盾更加明显。因此，如希望采用UFLC法分析复杂体系如药品的有关物质，一般不能通过简单的方法转换而实现，而应根据研究对象的特性及UFLC色谱柱的性质，通过深入的实验研究建立相应的分析方法。