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摘要：目的 观察风湿痹痛方对胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠血清细胞因子及滑膜组织Fas/FasL mRNA表达的影响，探讨其相关的作用机制。方法 采用大鼠足部皮内注射牛Ⅱ型胶原乳化剂方法建立CIA模型。实验大鼠随机分为空白组、模型组、雷公藤多苷组和风湿痹痛方低、中、高各剂量组，各给药组给予相应药物灌胃，连续14 d。观察各组大鼠体质量和关节炎评分；ELISA检测血清白细胞介素（IL）-1β、IL-15、转化生长因子（TGF）-β1含量；RT-PCR检测滑膜组织Fas、FasL的mRNA表达。结果 与模型组比较，风湿痹痛方中、高剂量组大鼠足部关节炎评分和血清IL-15含量显著降低，TGF-β1含量显著升高（P<0.01），风湿痹痛方高剂量组Fas mRNA表达显著降低，FasL mRNA表达显著升高（P<0.05）。结论 风湿痹痛方对CIA有一定的免疫调节作用，其机制可能是通过调控Fas/FasL凋亡系统，诱导滑膜组织细胞凋亡，抑制滑膜增生。
关键词：风湿痹痛方；胶原诱导型关节炎；炎性因子；细胞凋亡；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0052-04
Effects of Fengshi Bitong Prescription on Cytokines in Serum and Synovial Fas/FasL mRNA Expression in Rats with Collagen-Induced Arthritis LIANG Wei1， ZHOU Qun2， SHEN Jia-min2， WU Gen-gen2， ZHANG Li-ling1， CHEN Ye1， YAO Liang-yu3 （1. No.454 Hospital of PLA， Nanjing 210002， China； 2.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 3. Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China）
Abstract： Objective To observe the effects of Fengshi Bitong Prescription （FSBT） on cytokines in serum and Fas/FasL mRNA expression system in synovium； To discuss relevant mechanism of action. Methods Rats were given foot intradermal injection of bovine type Ⅱ collagen emulsion to establish collagen-induced arthritis （CIA） model. After successful modeling， they were randomly divided into 6 groups： normal control group， CIA model group， tripterygium glycosides group， FSBT high-， medium-， and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 14 d. The weight and arthritis scores of CIA rats were observed. Serum levels of IL-1β， IL-15， and TGF-β1 were detected by ELISA. Expressions of Fas and FasL mRNA in synovium of CIA rats were detected by real-time PCR. Results Compared with model group， the foot arthritis score and serum levels of IL-15 in FSBT high- and medium-dose groups significantly decreased （P<0.01）， and the serum level of TGF-β1 significantly increased （P<0.05）. Expression of Fas significantly decreased and FasL significantly increased in FSBT high-dose group （P<0.05）. Conclusion FSBT may have certain immune regulation effects on rheumatoid arthritis. Its mechanism may be in regulating Fas/FasL apoptosis system， thereby inducing apoptosis of synovial cells and inhibiting synovial hyperplasia.
Key words： Fengshi Bitong Prescription； collagen-induced arthritis； cytokine； apoptosis； rats
類风湿关节炎是一种以关节滑膜慢性炎症为主的全身性慢性自身免疫系统疾病，伴有关节滑膜增生、关节软骨、骨组织破坏，严重可导致关节畸形及功能丧失，其主要病机为气血亏虚、风寒湿邪外侵、化毒内郁、气滞血瘀、脉络痹阻。前期研究表明，风湿痹痛方对类风湿关节炎模型大鼠具有免疫调节作用，可提高caspase-8的表达，影响Fas/FasL介导的滑膜细胞凋亡，减少关节损伤[1]。本实验采用大鼠足部皮内注射牛Ⅱ型胶原乳化剂，建立胶原诱导型关节炎（CIA）模型，观察风湿痹痛方对CIA大鼠血清白细胞介素（IL）-1β、IL-15、转化生长因子（TGF）-β1含量及滑膜组织Fas、FasL mRNA表达的影响，探讨其相关的作用机制，为风湿痹痛方的临床应用提供实验依据。 1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，鼠龄8周，体质量220～250 g，上海杰思捷实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2013-0003。饲养于室温（24±1）℃、相对湿度（55±10）%的环境，光照明暗交替12 h/12 h，自由饮水摄食。
1.2 药物
风湿痹痛方（桂枝10 g、黄芪20 g、赤芍15 g、白芍15 g、当归10 g、细辛3 g、追地风15 g、忍冬藤15 g等），南京中医药大学提供，批号20170125；雷公藤多苷片，上海复旦复华药业有限公司，批号170108。
1.3 主要试剂与仪器
牛Ⅱ型胶原，Chondrex公司；弗氏完全佐剂，美国Sigma公司；大鼠IL-15、IL-1β和TGF-1β ELISA试剂盒，南京金益柏有限公司；Fas一抗，美国Proteintech公司；FasL一抗，北京博奥森生物公司。酶标仪（美国Bio-Tek公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），Lightcycler 96型PCR，Roche公司。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[2-3]方法造模。取适量牛Ⅱ型胶原，加入0.1 mol/L冰乙酸，4 ℃振荡过夜，浓度为8 mg/mL，再按1∶1加入弗式完全佐剂充分混合乳化，制成Ⅱ型胶原蛋白乳化剂，最终浓度为4 mg/mL。60只SD大鼠随机选取50只，右后足跖皮内注射0.1 mL/只胶原蛋白乳化剂制备CIA模型。造模后大鼠右后侧足部红肿明显、体积增大，表明造模成功。
2.2 分组和给药
将成模大鼠随机分为模型组、雷公藤多苷片组（7.5 mg/kg）和风湿痹痛方低、中、高剂量组（9.5、19、38 g/kg），每组10只，其余10只大鼠为空白组。致炎第14日开始，各给组给予相应浓度药液灌胃，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积为1 mL/100 g，每日1次，连续14 d。
2.3 体质量和足部关节炎评分
大鼠适应环境1周后，每周称量大鼠体质量，同時每隔1周进行大鼠足部关节炎测定评分，观察大鼠继发性病变。根据《中药药理实验方法学》[4]进行评分。0分：正常；1分：脚踝关节出现红斑及轻微肿胀；2分：踝关节到趾关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3分：踝关节到趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀；4分：踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。
2.4 白细胞介素-1β、白细胞介素-15、转化生长因子-β1含量检测
当日末次给药1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，取腹主动脉血，3000 r/min离心10 min，取血清-20 ℃保存。采用血清IL-1β、IL-15、TGF-β1 ELISA试剂盒测定含量，严格按试剂盒说明书进行操作。
2.5 滑膜组织Fas、FasL mRNA表达检测
将从大鼠后腿取出来的滑膜组织做成组织匀浆，Trizol法提取RNA，按PCR操作说明书检测滑膜组织Fas、FasL mRNA表达。基因引物见表1。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 风湿痹痛方对模型大鼠体质量和足部关节炎评分的影响
各组大鼠体质量未见明显差异，见表2。模型组大鼠关节炎评分较空白组差异明显；雷公藤多苷片组大鼠关节炎评分第21、28日和风湿痹痛方中、高剂量组大鼠第28日关节炎评分显著降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），见表3。
4.2 风湿痹痛方对模型大鼠血清相关细胞因子含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清IL-15、IL-1β含量显著升高，TGF-β1含量明显降低（P<0.01）；与模型组比较，风湿痹痛方高、中剂量组血清IL-15含量显著降低，TGF-β1含量明显升高（P<0.01），IL-1β含量各剂量组有下降趋势（P>0.05）。结果见表4。
4.3 风湿痹痛方对模型大鼠滑膜组织Fas、FasL mRNA表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠滑膜组织Fas mRNA表达显著升高，FasL mRNA表达显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，风湿痹痛方高剂量组和雷公藤多苷片组Fas mRNA表达显著下降，FasL mRNA表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果见表5。
5 讨论
类风湿关节炎属中医学“痹证”范畴。风湿痹痛方中桂枝、追地风、细辛祛风散寒、温经通络，黄芪、白芍、当归益气养血、活血通络，忍冬藤、赤芍清热解毒消肿、凉血化瘀。全方共奏补益气血、祛风散寒、温经通络、解毒消肿、行气活血、化瘀止痛之功。类风湿关节炎是以关节滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其致病与多种免疫活性细胞的活化及细胞因子、炎症介质相关，并与滑膜组织细胞凋亡障碍、滑膜增生相关。
IL-l主要来源于单核细胞及巨噬细胞，是类风湿关节炎炎症相关的重要细胞因子，刺激B细胞和T细胞释放细胞因子和抗体，同时刺激软骨细胞和滑膜细胞释放细胞毒素。1L-15主要由黏附性外周血单个核细胞产生，可以促进淋巴细胞、自然杀伤细胞的增殖、分化和调控，诱导T细胞的活化和免疫球蛋白的分泌，能刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1和IL-17等炎性细胞因子的产生，增强或促进血管内皮细胞与白细胞间的黏附，有助于白细胞聚集于炎症局部，并通过增加Bcl-x（L）和Bcl-2的表达，促进滑膜T细胞增殖。TGF-β1是一种重要的调节细胞生长、分化的多肽因子，具有调控血管内皮细胞生长、炎症细胞趋化、成纤维细胞增生及细胞外基质的合成与降解等作用，其在类风湿关节炎的发病中起重要作用[5]。Fas又称为CD95，该蛋白体的C端在细胞膜内，负责传递细胞凋亡的信号，N端在细胞膜外，负责与特异性Fas配体（FasL）结合并诱导细胞程序性死亡。研究发现，类风湿关节炎时滑膜细胞增生，与凋亡抑制有关，Fas/FasL系统在类风湿关节炎的病理过程中具有重要调控作用[6-7]。 本实验结果表明，风湿痹痛方可降低CIA大鼠关节炎评分，显著下调血清IL-15水平，明显升高TGF-β1含量，显著下调Fas mRNA表达，显著升高FasL mRNA表达。综上所述，风湿通痹方能抑制胶原性关节炎的炎症反应，具有免疫调节作用，并调控Fas/FasL凋亡系统，诱导滑膜细胞凋亡，抑制滑膜增生。本研究仅为风湿痹痛方药效和机制的初步探讨，今后将进一步开展细胞水平、蛋白表达水平研究，深入阐明该方的作用机理。
参考文献：
[1] 梁卫，梁涛，张丽玲，等.风湿痹痛方治疗大鼠胶原性关节炎的实验研究[J].中国中医急症，2017，26（1）：83-85.
[2] 李宝丽，唐方，庞晓东.Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠模型制备[J].中国免疫学杂志，2006，22（4）：350.
[3] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2006：347.
[4] 魏伟，吴希美.李元建.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社， 2010：663.
[5] 孙丽霞.转化生长因子-β1与类风湿关节炎[J].河北医科大学学报， 2002，23（5）：310-312.
[6] PERLMAN H， PAGLIARI L J， LIU H， et al. Rheumatoid arthritis synovial macrophages express the Fas assciated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme-inhibitory protein and are refractory to Fas mediated apoptosis[J]. Arthritis Rheum，2001， 44（1）：21-30.
[7] DRYNDA A， QUAX P H， NEUMANN M， et al. Gene transfer of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 reverses the inhibitor effects of TNF-alpha on Fas-induced apoptosis in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J]. J Immunol，2005，174（10）：6524-6531.
（收稿日期：2017-05-08）
（修回日期：2017-06-11；編辑：华强）
关键词：风湿痹痛方；胶原诱导型关节炎；炎性因子；细胞凋亡；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0052-04
Effects of Fengshi Bitong Prescription on Cytokines in Serum and Synovial Fas/FasL mRNA Expression in Rats with Collagen-Induced Arthritis LIANG Wei1， ZHOU Qun2， SHEN Jia-min2， WU Gen-gen2， ZHANG Li-ling1， CHEN Ye1， YAO Liang-yu3 （1. No.454 Hospital of PLA， Nanjing 210002， China； 2.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 3. Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China）
Abstract： Objective To observe the effects of Fengshi Bitong Prescription （FSBT） on cytokines in serum and Fas/FasL mRNA expression system in synovium； To discuss relevant mechanism of action. Methods Rats were given foot intradermal injection of bovine type Ⅱ collagen emulsion to establish collagen-induced arthritis （CIA） model. After successful modeling， they were randomly divided into 6 groups： normal control group， CIA model group， tripterygium glycosides group， FSBT high-， medium-， and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 14 d. The weight and arthritis scores of CIA rats were observed. Serum levels of IL-1β， IL-15， and TGF-β1 were detected by ELISA. Expressions of Fas and FasL mRNA in synovium of CIA rats were detected by real-time PCR. Results Compared with model group， the foot arthritis score and serum levels of IL-15 in FSBT high- and medium-dose groups significantly decreased （P<0.01）， and the serum level of TGF-β1 significantly increased （P<0.05）. Expression of Fas significantly decreased and FasL significantly increased in FSBT high-dose group （P<0.05）. Conclusion FSBT may have certain immune regulation effects on rheumatoid arthritis. Its mechanism may be in regulating Fas/FasL apoptosis system， thereby inducing apoptosis of synovial cells and inhibiting synovial hyperplasia.
Key words： Fengshi Bitong Prescription； collagen-induced arthritis； cytokine； apoptosis； rats
類风湿关节炎是一种以关节滑膜慢性炎症为主的全身性慢性自身免疫系统疾病，伴有关节滑膜增生、关节软骨、骨组织破坏，严重可导致关节畸形及功能丧失，其主要病机为气血亏虚、风寒湿邪外侵、化毒内郁、气滞血瘀、脉络痹阻。前期研究表明，风湿痹痛方对类风湿关节炎模型大鼠具有免疫调节作用，可提高caspase-8的表达，影响Fas/FasL介导的滑膜细胞凋亡，减少关节损伤[1]。本实验采用大鼠足部皮内注射牛Ⅱ型胶原乳化剂，建立胶原诱导型关节炎（CIA）模型，观察风湿痹痛方对CIA大鼠血清白细胞介素（IL）-1β、IL-15、转化生长因子（TGF）-β1含量及滑膜组织Fas、FasL mRNA表达的影响，探讨其相关的作用机制，为风湿痹痛方的临床应用提供实验依据。 1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，鼠龄8周，体质量220～250 g，上海杰思捷实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2013-0003。饲养于室温（24±1）℃、相对湿度（55±10）%的环境，光照明暗交替12 h/12 h，自由饮水摄食。
1.2 药物
风湿痹痛方（桂枝10 g、黄芪20 g、赤芍15 g、白芍15 g、当归10 g、细辛3 g、追地风15 g、忍冬藤15 g等），南京中医药大学提供，批号20170125；雷公藤多苷片，上海复旦复华药业有限公司，批号170108。
1.3 主要试剂与仪器
牛Ⅱ型胶原，Chondrex公司；弗氏完全佐剂，美国Sigma公司；大鼠IL-15、IL-1β和TGF-1β ELISA试剂盒，南京金益柏有限公司；Fas一抗，美国Proteintech公司；FasL一抗，北京博奥森生物公司。酶标仪（美国Bio-Tek公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），Lightcycler 96型PCR，Roche公司。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[2-3]方法造模。取适量牛Ⅱ型胶原，加入0.1 mol/L冰乙酸，4 ℃振荡过夜，浓度为8 mg/mL，再按1∶1加入弗式完全佐剂充分混合乳化，制成Ⅱ型胶原蛋白乳化剂，最终浓度为4 mg/mL。60只SD大鼠随机选取50只，右后足跖皮内注射0.1 mL/只胶原蛋白乳化剂制备CIA模型。造模后大鼠右后侧足部红肿明显、体积增大，表明造模成功。
2.2 分组和给药
将成模大鼠随机分为模型组、雷公藤多苷片组（7.5 mg/kg）和风湿痹痛方低、中、高剂量组（9.5、19、38 g/kg），每组10只，其余10只大鼠为空白组。致炎第14日开始，各给组给予相应浓度药液灌胃，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积为1 mL/100 g，每日1次，连续14 d。
2.3 体质量和足部关节炎评分
大鼠适应环境1周后，每周称量大鼠体质量，同時每隔1周进行大鼠足部关节炎测定评分，观察大鼠继发性病变。根据《中药药理实验方法学》[4]进行评分。0分：正常；1分：脚踝关节出现红斑及轻微肿胀；2分：踝关节到趾关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3分：踝关节到趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀；4分：踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。
2.4 白细胞介素-1β、白细胞介素-15、转化生长因子-β1含量检测
当日末次给药1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，取腹主动脉血，3000 r/min离心10 min，取血清-20 ℃保存。采用血清IL-1β、IL-15、TGF-β1 ELISA试剂盒测定含量，严格按试剂盒说明书进行操作。
2.5 滑膜组织Fas、FasL mRNA表达检测
将从大鼠后腿取出来的滑膜组织做成组织匀浆，Trizol法提取RNA，按PCR操作说明书检测滑膜组织Fas、FasL mRNA表达。基因引物见表1。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 风湿痹痛方对模型大鼠体质量和足部关节炎评分的影响
各组大鼠体质量未见明显差异，见表2。模型组大鼠关节炎评分较空白组差异明显；雷公藤多苷片组大鼠关节炎评分第21、28日和风湿痹痛方中、高剂量组大鼠第28日关节炎评分显著降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），见表3。
4.2 风湿痹痛方对模型大鼠血清相关细胞因子含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清IL-15、IL-1β含量显著升高，TGF-β1含量明显降低（P<0.01）；与模型组比较，风湿痹痛方高、中剂量组血清IL-15含量显著降低，TGF-β1含量明显升高（P<0.01），IL-1β含量各剂量组有下降趋势（P>0.05）。结果见表4。
4.3 风湿痹痛方对模型大鼠滑膜组织Fas、FasL mRNA表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠滑膜组织Fas mRNA表达显著升高，FasL mRNA表达显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，风湿痹痛方高剂量组和雷公藤多苷片组Fas mRNA表达显著下降，FasL mRNA表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果见表5。
5 讨论
类风湿关节炎属中医学“痹证”范畴。风湿痹痛方中桂枝、追地风、细辛祛风散寒、温经通络，黄芪、白芍、当归益气养血、活血通络，忍冬藤、赤芍清热解毒消肿、凉血化瘀。全方共奏补益气血、祛风散寒、温经通络、解毒消肿、行气活血、化瘀止痛之功。类风湿关节炎是以关节滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其致病与多种免疫活性细胞的活化及细胞因子、炎症介质相关，并与滑膜组织细胞凋亡障碍、滑膜增生相关。
IL-l主要来源于单核细胞及巨噬细胞，是类风湿关节炎炎症相关的重要细胞因子，刺激B细胞和T细胞释放细胞因子和抗体，同时刺激软骨细胞和滑膜细胞释放细胞毒素。1L-15主要由黏附性外周血单个核细胞产生，可以促进淋巴细胞、自然杀伤细胞的增殖、分化和调控，诱导T细胞的活化和免疫球蛋白的分泌，能刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1和IL-17等炎性细胞因子的产生，增强或促进血管内皮细胞与白细胞间的黏附，有助于白细胞聚集于炎症局部，并通过增加Bcl-x（L）和Bcl-2的表达，促进滑膜T细胞增殖。TGF-β1是一种重要的调节细胞生长、分化的多肽因子，具有调控血管内皮细胞生长、炎症细胞趋化、成纤维细胞增生及细胞外基质的合成与降解等作用，其在类风湿关节炎的发病中起重要作用[5]。Fas又称为CD95，该蛋白体的C端在细胞膜内，负责传递细胞凋亡的信号，N端在细胞膜外，负责与特异性Fas配体（FasL）结合并诱导细胞程序性死亡。研究发现，类风湿关节炎时滑膜细胞增生，与凋亡抑制有关，Fas/FasL系统在类风湿关节炎的病理过程中具有重要调控作用[6-7]。 本实验结果表明，风湿痹痛方可降低CIA大鼠关节炎评分，显著下调血清IL-15水平，明显升高TGF-β1含量，显著下调Fas mRNA表达，显著升高FasL mRNA表达。综上所述，风湿通痹方能抑制胶原性关节炎的炎症反应，具有免疫调节作用，并调控Fas/FasL凋亡系统，诱导滑膜细胞凋亡，抑制滑膜增生。本研究仅为风湿痹痛方药效和机制的初步探讨，今后将进一步开展细胞水平、蛋白表达水平研究，深入阐明该方的作用机理。
参考文献：
[1] 梁卫，梁涛，张丽玲，等.风湿痹痛方治疗大鼠胶原性关节炎的实验研究[J].中国中医急症，2017，26（1）：83-85.
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[6] PERLMAN H， PAGLIARI L J， LIU H， et al. Rheumatoid arthritis synovial macrophages express the Fas assciated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme-inhibitory protein and are refractory to Fas mediated apoptosis[J]. Arthritis Rheum，2001， 44（1）：21-30.
[7] DRYNDA A， QUAX P H， NEUMANN M， et al. Gene transfer of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 reverses the inhibitor effects of TNF-alpha on Fas-induced apoptosis in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J]. J Immunol，2005，174（10）：6524-6531.
（收稿日期：2017-05-08）
（修回日期：2017-06-11；編辑：华强）