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摘要：目的 探讨天芪益智颗粒治疗阿尔茨海默病（AD）的作用机制。方法 将SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组及天芪益智颗粒高、中、低剂量组，大鼠左侧脑室注射聚集态Aβ1-42建立AD模型，各治疗组给予相应药物灌胃，假手术组和模型组大鼠给予等体积生理盐水，每日1次，连续30 d。检测大鼠脑组织线粒体膜电位、线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性，Na+-K+ ATP酶活性，脑组织能荷及空间学习记忆能力。结果 与模型组比较，天芪益智颗粒可显著增加AD大鼠脑组织线粒体膜电位，提高呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Na+-K+ ATP酶活性和AD大鼠脑能量代谢水平，改善AD大鼠空间学习记忆能力。结论 天芪益智颗粒具有线粒体保护作用，可改善AD大鼠脑组织能量代谢，进而提高其空间学习记忆能力。
关键词：天芪益智颗粒；阿尔茨海默病；线粒体；能量代谢；学习记忆；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0060-05
Abstract：Objective To investigate the action mechanism of Tianqi Yizhi Granules for Alzheimer disease. Methods Ninety SD rats were divided into sham-operation group， model group， positive medicine group， high， medium and low dosage of Tianqi Yizhi Granules groups. SD rats were injected with aggregated amyloid β1-42 protein （Aβ1-42） into their left ventricle to establish AD models. Treatment groups received gavage with Huperzine A or Tianqi Yizhi Granules. The sham-operation group and model group received gavage with the same volume of normal saline. The mitochondrial membrane potential， activity of complex Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ of mitochondrial respiratory chain， enzymatic activity of Na+-K+ ATP， energy charge， and space leaning ability were detected. Results Compared with model group， Tianqi Yizhi Granules could significantly improve mitochondrial membrane potential， activity of complex Ⅰ， Ⅲ and Ⅳ of mitochondrial respiratory chain， enzymatic activity of Na+-K+ ATP， space leaning ability， and energy metabolism of brain in AD rats. Conclusion Tianqi Yizhi Granules showed mitochondrial protective capacity， and could improve energy metabolism of brain in AD rats， and then improve AD rats’ space learning ability.
Key words：Tianqi Yizhi Granules；Alzheimer disease；mitochondria；energy metabolism；learning memory；rats
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种神经退行性疾病，病程长且无法逆转，针对发病早期阶段进行干预是目前治疗AD的有效策略[1]。线粒体是细胞内产生能量和氧自由基的主要细胞器，研究发现，在发病早期，AD患者脑细胞即出现了线粒体功能紊乱，主要表现为能量代谢衰竭、氧自由基增多、线粒体膜通透性增加等，线粒体损伤导致的能量代谢障碍和氧化损伤是AD早期重要病理事件[2-4]。由β-淀粉样蛋白（Aβ）过度累积形成的老年斑是AD的典型病理特征，其中Aβ1-42蛋白寡聚化后具有神经毒性，可造成线粒体应激、膜损伤等。天芪益智颗粒源自王永炎院士治疗痴呆临床经验方，由红芪、红景天组成，具有升阳益气、活血通络的功效。本实验以Aβ1-42致痴呆大鼠为模型，观察天芪益智颗粒对模型大鼠脑组织线粒体功能及脑内能量代谢的影响，评价其对模型大鼠学习记忆能力的改善作用，并探讨其治疗AD的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
4月龄SD大鼠90只，雄性，体质量250～300 g， SPF级，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2009-0015。SPF级环境饲养，温度（21±3）℃，相对湿度40%±5%，大鼠维持饲料自由饮食，12 h明暗交替。
1.2 药物
天芪益智颗粒由红芪18 g、红景天6 g组成，以水提法制备，6.4 g原药材/g，以红景天苷做为质控指标，北京中医药大学中药学院提供，批号20140913。按照人临床日用药量24 g原药材折算大鼠给药量，将天芪益智颗粒稀释成0.08、0.16、0.32 g/mL 3个浓度。阳性对照药石杉碱甲片，河南太龙药业股份有限公司生产，批号130814A，配制成0.006 mg/mL溶液。 1.3 主要试剂与仪器
Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司；六氟异丙醇、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、单磷酸腺苷（AMP）及磷酸肌酸（PCr），Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测定试剂盒（Genmed Scientifics公司）；超微量Na+-K+ ATP酶活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），其他试剂为国产分析纯。DMS-2 Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；5810R台式多功能高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；2695高效液相色谱仪（Waters公司）；FLX800酶标仪（Biotex公司）；Ultrospec 3300 pro分光光度计（Amersham Biosciences公司）。
1.4 分组及给药
SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组及天芪益智颗粒高、中、低剂量组（简称中药高、中、低剂量组），每组15只。大鼠造模1周后开始灌胃给药，中药高、中、低剂量组分别给予3.2、1.6、0.8 g/kg灌胃给药，阳性药组给予石杉碱甲0.02 mg/kg，给药体积20 mL/kg，假手术组和模型组灌服等体积生理盐水。每日1次，连续30 d。
1.5 造模
参考文献[5]方法，并结合本实验调整。将1 mg Aβ1-42溶于六氟异丙醇至浓度为4.5 mg/mL，室温孵育60 min，真空冷冻干燥，-20 ℃保存。使用前重新溶解于DMSO中，超声（功率300 W，频率35 Hz）处理10 min，稀释于PBS中至终浓度2 μg/μL，4 ℃孵育24 h。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，手术区消毒，在颅顶中间部作一纵切口，暴露颅骨，在前卤后0.8 mm、中线旁1.5 mm处用牙科钻钻开颅骨，垂直插入微量进样器进针3.5 mm，将Aβ1-42 5 μL以1 μL/min的速度缓慢注入大鼠侧脑室，留针5 min以保证溶液充分弥散，随后缓慢撤针。皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切口。假手术组注入等体积生理盐水，其他操作同上。
1.6 Morris水迷宫实验
给药30 d后，进行Morris水迷宫实验。首先进行定位航行实验，训练5 d，期间继续给药。测定大鼠寻找平台的逃避潜伏期。定位航行实验结束后第1日，将平台取出，进行空间探索实验1 d，测定大鼠穿越平台目标区域次数、在目标象限及相对象限停留时间。
1.7 大鼠脑组织能荷和高能磷酸测定
Morris水迷宫实验后，断头处死大鼠，取出脑组织称重，按1∶10比例加入预冷的生理盐水在冰浴下匀浆，取0.6 mL脑匀浆液，加入等体积0.5 mol/L高氯酸涡旋混匀，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清0.8 mL加入45 μL 5 mol/L NaOH，静置30 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，去上清液直接进样，采用高效液相色谱法梯度洗脱，测定ATP、ADP、AMP及PCr含量。色谱条件：ODS HYPERSIL C18色谱分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.05 mol/L PBS缓冲液（pH 6.5），流动相B为甲醇，流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；样品室温度10 ℃；进样体积10 ?L；紫外检测波长254 nm；实验采用外标法定量。计算能荷（EC）。
EC= （[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）
1.8 大鼠脑组织线粒体提取及呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测定
Morris水迷宫实验后，断头处死大鼠，迅速取出脑组织称重后置于匀浆器中，加入0.25 mol/L蔗糖溶液5 mL，在冰上匀浆。匀浆液铺于等体积0.34 mol/L蔗糖溶液上，700×g离心10 min，取上清液，缓慢加速至5000×g离心10 min，去上清液，沉淀混悬于2 mL 0.25 mol/L蔗糖溶液中，5000×g离心20 min，沉淀即为线粒体。重复离心清洗1次，重悬沉淀于0.25 mol/L蔗糖溶液中。以BCA法测定蛋白浓度，以PBS调节蛋白浓度分别用于复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ测定。按照试剂盒说明书操作，在酶标仪上分别以450、600、550 nm检测复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性。复合物Ⅰ、Ⅱ的活性分别以每1 μg线粒体蛋白中OD450值/min、OD600值/min的变化率表示，复合物Ⅲ、Ⅳ活性以每1 μg线粒体蛋白中OD550值/min的变化率表示。
1.9 大鼠脑组织线粒体Na+-K+ ATP酶活性测定
ATP酶分解ATP产生ADP和磷酸盐，以单位时间内产生的磷酸盐量计算ATP酶活性。按试剂盒说明操作，以单位时间（1 h）内每1 mg组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1 μmol磷酸盐的量为1个ATP酶活力单位。
1.10 大鼠脑组织线粒体膜电位测定
按试剂盒说明书操作，分离提取大鼠脑组织线粒体，用PBS溶解，取200 μL移入1.5 mL离心管内，加PBS至1.5 mL，混匀离心。取沉淀加入1.25 mL staining mixture，37 ℃避光孵育3 min。酶标仪检测590 nm和530 nm荧光强度，以两者比值计算线粒体膜电位。
1.11 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，各组间比较用ANOVA结合Post Hoc检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 天芪益智颗粒对大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的影响 与假手术组比较，模型大鼠脑组织线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均显著降低（P<0.01），中药高、中、低剂量组可显著提高模型大鼠脑组织线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性（P<0.01）；中药高剂量组可显著提高线粒体复合物Ⅱ活性（P<0.05），中药中、低剂量组对复合物Ⅱ活性有提高趋势，但差异无统计学意义。结果见表1。
2.2 天芪益智颗粒对大鼠脑组织Na+-K+ ATP酶活性和线粒体膜电位的影响
与假手术组比较，模型组大鼠Na+-K+ ATP酶活性和线粒体膜电位显著降低（P<0.01）；中药高、中、低剂量组均能显著提高模型大鼠Na+-K+ ATP酶活性和线粒体膜电位（P<0.01）。结果见表2。
2.3 天芪益智颗粒对Aβ1-42致痴呆大鼠脑组织能荷和高能磷酸含量的影响
与假手术组比较，模型组大鼠脑内ATP、ADP、PCr含量和EC值均显著降低（P<0.01）；中药高、中、低剂量组均能使模型大鼠ATP、ADP、PCr含量和EC值显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。
2.4 天芪益智颗粒对大鼠空间学习记忆能力的影响
Morris水迷宫实验结果显示，与假手术组比较，模型大鼠空间学习记忆能力显著下降。定位航行实验第3、4、5日，各治疗组均能缩短模型大鼠逃避潜伏期（P<0.05，P<0.01），见表4。空间探索实验结果显示，中药高、中、低剂量组均能增加模型大鼠穿越目标区域的次数（P<0.01），增加在目标象限的停留时间（P<0.01），中药高、中剂量组均可减少模型大鼠在相对象限的停留时间（P<0.05，P<0.01），见表5。
3 讨论
在AD患者发病早期即可发现脑能量代谢障碍。研究表明，AD患者葡萄糖/能量代谢障碍往往发生在临床症状出现之前[6-7]，而且脑能量代谢的改变与认知能力下降呈现正相关[8]。机体内能量代谢的亚细胞结构是线粒体，线粒体功能紊乱是AD早期脑内的重要病理改变，包括膜结构破坏、氧化磷酸化受损、呼吸链电子传递受阻、ATP酶活性下降等，导致ATP合成减少，蛋白质降解，突触转运和胞内离子平衡改变等[7-10]。鉴于AD起病隐袭，病程缓慢而不可逆，针对发病早期病理过程进行干预具有重要临床意义。
Aβ蛋白是AD患者脑内淀粉样斑块沉积的主要成分，有Aβ1-40和Aβ1-42两种形式。其中Aβ1-42因为更易于寡聚化形成有毒性的聚集态Aβ而更具毒性，在AD患者脑内所占的比例也更大[11]。Aβ蛋白具有多种毒性作用，包括破坏细胞膜结构、引起线粒体应激、氧化应激、炎症反应、钙离子失衡及神经突触损伤等[11-12]。为此，目前研究多采用脑内定位注射Aβ蛋白来制作拟痴呆动物模型。本实验通过在大鼠侧脑室注射毒性聚集态Aβ1-42模拟AD病理过程[13-14]。
有学者认为，脑络痹阻、毒损脑络是AD重要病机，老年肾虚导致肾精衰退，气血亏虚，血行涩滞，脑络痹阻，毒损脑络，以致痴呆[15-17]。针对这一病机，临床上采用升阳益气、活血通络法治疗该病。天芪益智颗粒具有升阳补气、益气活血、通络化瘀之功效。其中君药红芪升阳补气，臣药红景天活血通络，两药合用共同发挥升阳益精、补气活血、通络醒脑之功效。
本实验从能量代谢角度研究益气活血方药天芪益智颗粒对Aβ1-42致痴呆大鼠脑内线粒体功能的保护及对认知能力的改善作用，并探讨AD能量代谢改善与益气活血治法之间的内在联系。本实验结果显示，天芪益智颗粒可以增加模型大鼠脑组织线粒体膜电位，表明药物可改善线粒体膜结构完整性。线粒体内膜上的呼吸链复合物和ATP酶活性高度依赖内膜完整性，对于线粒体能量代谢发挥关键作用。天芪益智颗粒可明显增加AD模型大鼠脑线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的活性，提高氧化磷酸化和能量代谢水平，改善学习记忆能力。本研究揭示了益气活血治法对AD大鼠脑组织以线粒体损伤为核心的能量代谢障碍的改善作用，而能量代谢障碍是AD早期最重要的病理改变之一，提示采用益气活血治法在AD早期干预对于AD防治的重要临床意义。但天芪益智颗粒对线粒体保护的确切分子靶点还不够明确，有待于进一步研究。
参考文献：
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（收稿日期：2014-11-05）
（修回日期：2014-11-21；编辑：华强）
关键词：天芪益智颗粒；阿尔茨海默病；线粒体；能量代谢；学习记忆；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0060-05
Abstract：Objective To investigate the action mechanism of Tianqi Yizhi Granules for Alzheimer disease. Methods Ninety SD rats were divided into sham-operation group， model group， positive medicine group， high， medium and low dosage of Tianqi Yizhi Granules groups. SD rats were injected with aggregated amyloid β1-42 protein （Aβ1-42） into their left ventricle to establish AD models. Treatment groups received gavage with Huperzine A or Tianqi Yizhi Granules. The sham-operation group and model group received gavage with the same volume of normal saline. The mitochondrial membrane potential， activity of complex Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ of mitochondrial respiratory chain， enzymatic activity of Na+-K+ ATP， energy charge， and space leaning ability were detected. Results Compared with model group， Tianqi Yizhi Granules could significantly improve mitochondrial membrane potential， activity of complex Ⅰ， Ⅲ and Ⅳ of mitochondrial respiratory chain， enzymatic activity of Na+-K+ ATP， space leaning ability， and energy metabolism of brain in AD rats. Conclusion Tianqi Yizhi Granules showed mitochondrial protective capacity， and could improve energy metabolism of brain in AD rats， and then improve AD rats’ space learning ability.
Key words：Tianqi Yizhi Granules；Alzheimer disease；mitochondria；energy metabolism；learning memory；rats
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种神经退行性疾病，病程长且无法逆转，针对发病早期阶段进行干预是目前治疗AD的有效策略[1]。线粒体是细胞内产生能量和氧自由基的主要细胞器，研究发现，在发病早期，AD患者脑细胞即出现了线粒体功能紊乱，主要表现为能量代谢衰竭、氧自由基增多、线粒体膜通透性增加等，线粒体损伤导致的能量代谢障碍和氧化损伤是AD早期重要病理事件[2-4]。由β-淀粉样蛋白（Aβ）过度累积形成的老年斑是AD的典型病理特征，其中Aβ1-42蛋白寡聚化后具有神经毒性，可造成线粒体应激、膜损伤等。天芪益智颗粒源自王永炎院士治疗痴呆临床经验方，由红芪、红景天组成，具有升阳益气、活血通络的功效。本实验以Aβ1-42致痴呆大鼠为模型，观察天芪益智颗粒对模型大鼠脑组织线粒体功能及脑内能量代谢的影响，评价其对模型大鼠学习记忆能力的改善作用，并探讨其治疗AD的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
4月龄SD大鼠90只，雄性，体质量250～300 g， SPF级，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2009-0015。SPF级环境饲养，温度（21±3）℃，相对湿度40%±5%，大鼠维持饲料自由饮食，12 h明暗交替。
1.2 药物
天芪益智颗粒由红芪18 g、红景天6 g组成，以水提法制备，6.4 g原药材/g，以红景天苷做为质控指标，北京中医药大学中药学院提供，批号20140913。按照人临床日用药量24 g原药材折算大鼠给药量，将天芪益智颗粒稀释成0.08、0.16、0.32 g/mL 3个浓度。阳性对照药石杉碱甲片，河南太龙药业股份有限公司生产，批号130814A，配制成0.006 mg/mL溶液。 1.3 主要试剂与仪器
Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司；六氟异丙醇、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、单磷酸腺苷（AMP）及磷酸肌酸（PCr），Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测定试剂盒（Genmed Scientifics公司）；超微量Na+-K+ ATP酶活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），其他试剂为国产分析纯。DMS-2 Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；5810R台式多功能高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；2695高效液相色谱仪（Waters公司）；FLX800酶标仪（Biotex公司）；Ultrospec 3300 pro分光光度计（Amersham Biosciences公司）。
1.4 分组及给药
SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组及天芪益智颗粒高、中、低剂量组（简称中药高、中、低剂量组），每组15只。大鼠造模1周后开始灌胃给药，中药高、中、低剂量组分别给予3.2、1.6、0.8 g/kg灌胃给药，阳性药组给予石杉碱甲0.02 mg/kg，给药体积20 mL/kg，假手术组和模型组灌服等体积生理盐水。每日1次，连续30 d。
1.5 造模
参考文献[5]方法，并结合本实验调整。将1 mg Aβ1-42溶于六氟异丙醇至浓度为4.5 mg/mL，室温孵育60 min，真空冷冻干燥，-20 ℃保存。使用前重新溶解于DMSO中，超声（功率300 W，频率35 Hz）处理10 min，稀释于PBS中至终浓度2 μg/μL，4 ℃孵育24 h。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，手术区消毒，在颅顶中间部作一纵切口，暴露颅骨，在前卤后0.8 mm、中线旁1.5 mm处用牙科钻钻开颅骨，垂直插入微量进样器进针3.5 mm，将Aβ1-42 5 μL以1 μL/min的速度缓慢注入大鼠侧脑室，留针5 min以保证溶液充分弥散，随后缓慢撤针。皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切口。假手术组注入等体积生理盐水，其他操作同上。
1.6 Morris水迷宫实验
给药30 d后，进行Morris水迷宫实验。首先进行定位航行实验，训练5 d，期间继续给药。测定大鼠寻找平台的逃避潜伏期。定位航行实验结束后第1日，将平台取出，进行空间探索实验1 d，测定大鼠穿越平台目标区域次数、在目标象限及相对象限停留时间。
1.7 大鼠脑组织能荷和高能磷酸测定
Morris水迷宫实验后，断头处死大鼠，取出脑组织称重，按1∶10比例加入预冷的生理盐水在冰浴下匀浆，取0.6 mL脑匀浆液，加入等体积0.5 mol/L高氯酸涡旋混匀，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清0.8 mL加入45 μL 5 mol/L NaOH，静置30 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，去上清液直接进样，采用高效液相色谱法梯度洗脱，测定ATP、ADP、AMP及PCr含量。色谱条件：ODS HYPERSIL C18色谱分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.05 mol/L PBS缓冲液（pH 6.5），流动相B为甲醇，流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；样品室温度10 ℃；进样体积10 ?L；紫外检测波长254 nm；实验采用外标法定量。计算能荷（EC）。
EC= （[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）
1.8 大鼠脑组织线粒体提取及呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测定
Morris水迷宫实验后，断头处死大鼠，迅速取出脑组织称重后置于匀浆器中，加入0.25 mol/L蔗糖溶液5 mL，在冰上匀浆。匀浆液铺于等体积0.34 mol/L蔗糖溶液上，700×g离心10 min，取上清液，缓慢加速至5000×g离心10 min，去上清液，沉淀混悬于2 mL 0.25 mol/L蔗糖溶液中，5000×g离心20 min，沉淀即为线粒体。重复离心清洗1次，重悬沉淀于0.25 mol/L蔗糖溶液中。以BCA法测定蛋白浓度，以PBS调节蛋白浓度分别用于复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ测定。按照试剂盒说明书操作，在酶标仪上分别以450、600、550 nm检测复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性。复合物Ⅰ、Ⅱ的活性分别以每1 μg线粒体蛋白中OD450值/min、OD600值/min的变化率表示，复合物Ⅲ、Ⅳ活性以每1 μg线粒体蛋白中OD550值/min的变化率表示。
1.9 大鼠脑组织线粒体Na+-K+ ATP酶活性测定
ATP酶分解ATP产生ADP和磷酸盐，以单位时间内产生的磷酸盐量计算ATP酶活性。按试剂盒说明操作，以单位时间（1 h）内每1 mg组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1 μmol磷酸盐的量为1个ATP酶活力单位。
1.10 大鼠脑组织线粒体膜电位测定
按试剂盒说明书操作，分离提取大鼠脑组织线粒体，用PBS溶解，取200 μL移入1.5 mL离心管内，加PBS至1.5 mL，混匀离心。取沉淀加入1.25 mL staining mixture，37 ℃避光孵育3 min。酶标仪检测590 nm和530 nm荧光强度，以两者比值计算线粒体膜电位。
1.11 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，各组间比较用ANOVA结合Post Hoc检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 天芪益智颗粒对大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的影响 与假手术组比较，模型大鼠脑组织线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均显著降低（P<0.01），中药高、中、低剂量组可显著提高模型大鼠脑组织线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性（P<0.01）；中药高剂量组可显著提高线粒体复合物Ⅱ活性（P<0.05），中药中、低剂量组对复合物Ⅱ活性有提高趋势，但差异无统计学意义。结果见表1。
2.2 天芪益智颗粒对大鼠脑组织Na+-K+ ATP酶活性和线粒体膜电位的影响
与假手术组比较，模型组大鼠Na+-K+ ATP酶活性和线粒体膜电位显著降低（P<0.01）；中药高、中、低剂量组均能显著提高模型大鼠Na+-K+ ATP酶活性和线粒体膜电位（P<0.01）。结果见表2。
2.3 天芪益智颗粒对Aβ1-42致痴呆大鼠脑组织能荷和高能磷酸含量的影响
与假手术组比较，模型组大鼠脑内ATP、ADP、PCr含量和EC值均显著降低（P<0.01）；中药高、中、低剂量组均能使模型大鼠ATP、ADP、PCr含量和EC值显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。
2.4 天芪益智颗粒对大鼠空间学习记忆能力的影响
Morris水迷宫实验结果显示，与假手术组比较，模型大鼠空间学习记忆能力显著下降。定位航行实验第3、4、5日，各治疗组均能缩短模型大鼠逃避潜伏期（P<0.05，P<0.01），见表4。空间探索实验结果显示，中药高、中、低剂量组均能增加模型大鼠穿越目标区域的次数（P<0.01），增加在目标象限的停留时间（P<0.01），中药高、中剂量组均可减少模型大鼠在相对象限的停留时间（P<0.05，P<0.01），见表5。
3 讨论
在AD患者发病早期即可发现脑能量代谢障碍。研究表明，AD患者葡萄糖/能量代谢障碍往往发生在临床症状出现之前[6-7]，而且脑能量代谢的改变与认知能力下降呈现正相关[8]。机体内能量代谢的亚细胞结构是线粒体，线粒体功能紊乱是AD早期脑内的重要病理改变，包括膜结构破坏、氧化磷酸化受损、呼吸链电子传递受阻、ATP酶活性下降等，导致ATP合成减少，蛋白质降解，突触转运和胞内离子平衡改变等[7-10]。鉴于AD起病隐袭，病程缓慢而不可逆，针对发病早期病理过程进行干预具有重要临床意义。
Aβ蛋白是AD患者脑内淀粉样斑块沉积的主要成分，有Aβ1-40和Aβ1-42两种形式。其中Aβ1-42因为更易于寡聚化形成有毒性的聚集态Aβ而更具毒性，在AD患者脑内所占的比例也更大[11]。Aβ蛋白具有多种毒性作用，包括破坏细胞膜结构、引起线粒体应激、氧化应激、炎症反应、钙离子失衡及神经突触损伤等[11-12]。为此，目前研究多采用脑内定位注射Aβ蛋白来制作拟痴呆动物模型。本实验通过在大鼠侧脑室注射毒性聚集态Aβ1-42模拟AD病理过程[13-14]。
有学者认为，脑络痹阻、毒损脑络是AD重要病机，老年肾虚导致肾精衰退，气血亏虚，血行涩滞，脑络痹阻，毒损脑络，以致痴呆[15-17]。针对这一病机，临床上采用升阳益气、活血通络法治疗该病。天芪益智颗粒具有升阳补气、益气活血、通络化瘀之功效。其中君药红芪升阳补气，臣药红景天活血通络，两药合用共同发挥升阳益精、补气活血、通络醒脑之功效。
本实验从能量代谢角度研究益气活血方药天芪益智颗粒对Aβ1-42致痴呆大鼠脑内线粒体功能的保护及对认知能力的改善作用，并探讨AD能量代谢改善与益气活血治法之间的内在联系。本实验结果显示，天芪益智颗粒可以增加模型大鼠脑组织线粒体膜电位，表明药物可改善线粒体膜结构完整性。线粒体内膜上的呼吸链复合物和ATP酶活性高度依赖内膜完整性，对于线粒体能量代谢发挥关键作用。天芪益智颗粒可明显增加AD模型大鼠脑线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的活性，提高氧化磷酸化和能量代谢水平，改善学习记忆能力。本研究揭示了益气活血治法对AD大鼠脑组织以线粒体损伤为核心的能量代谢障碍的改善作用，而能量代谢障碍是AD早期最重要的病理改变之一，提示采用益气活血治法在AD早期干预对于AD防治的重要临床意义。但天芪益智颗粒对线粒体保护的确切分子靶点还不够明确，有待于进一步研究。
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（收稿日期：2014-11-05）
（修回日期：2014-11-21；编辑：华强）