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【摘要】目的:建立测定大补阴丸中黄柏含量的高效液相色谱方法。方法:采用Phenomenex C18色谱柱(250mm×4.6mm,4μm),以磷酸盐缓冲溶液[0.05mol/L磷酸二氢钾溶液和0.05mol/L十二烷基磺酸钠溶液(1:1)]-甲醇(70:30)为流动相,检测波长265nm,柱温为30℃,流速:1.0mL·min-1。结果:盐酸小檗碱回归方程为A=48.237C+0.8431,r=0.9995,线性范围2.036～40.72μg/mL。平均回收率为96.66%,RSD为1.26%。结论:该法操作简单,精密度高,重复性好,检测快速,定量准确,可用于大补阴丸的质量控制。
【关键词】大补阴丸;盐酸小檗碱;高效液相色谱法
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)14-039-1
大补阴丸由熟地黄、盐黄柏、盐知母、龟甲、猪脊髓五味药物组成,具有滋阴降火的功效,用于阴虚火旺、潮热盗汗、咳嗽咯血、耳鸣遗精等症。方中盐黄柏具有滋阴降火的功效,用于阴虚火旺、盗汗骨蒸等症;其主要成分为盐酸小檗碱,现采用高效液相色谱法测定大补阴丸中盐酸小檗碱的含量来确定制剂中盐黄柏的含量,方法简便,结果准确可靠,可用于大补阴丸的质量控制。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent1100系列高效液相色谱仪(包括四元梯度泵;紫外检测器;Agilent工作站)BP211D电子分析天平(Sartorius)。
1.2试药盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号0713-200608)甲醇为色谱,纯水为超纯水;其他试剂均为分析纯;大补阴丸为市售。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱:Phenomenex C18色谱柱(250mm×4.6mm,4μm);流动相为磷酸盐缓冲液[0.05mol/L磷酸二氢钾溶液和0.05mol/L十二烷基磺酸钠溶液(1:1)]-甲醇(70:30);流速:1.0ml/min;检测波长265nm,柱温为30℃;进样量;10µl;理论板数按盐酸小檗碱峰计算,应不低于4000。色谱图见图1。
2.2对照品溶液制备精密称取盐酸小檗碱对照品10.18mg,置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成每ml含101.8µg的溶液,作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1.3.5.10.15.20ml置50mL量瓶中,加甲醇制成浓度为2.036,6.108,10.18,20.36,30.54,40.72µg/ml的对照品系列浓度溶液,即得。
2.3供试品溶液的制备取本品(水蜜丸)适量,研细,取1g精密称定,置索氏提取器中精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液适量,加热回流提取至提取液无色,将提取液移至100ml量瓶中,用少量上述混合溶液洗涤容器,洗液并入同一量瓶中,加上述混合液至刻度,摇匀,精密量取5ml至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,作为供试品溶液。
2.4线性关系考察取2.2项下对照品系列浓度溶液,按2.1色谱条件进行测定,测得峰面积,以浓度(C)对峰面积(A)积分值进行线性回归,求得回归方程为A=48.237C+0.8431,r=0.9995。表明盐酸小檗碱在2.036-40.72µg/ml浓度范围内,线性良好。
2.5空白实验按照中国药典2005年版处方比例及制法制成不含黄柏的样品,并按供试品的制法制成阴性对照溶液,依法进行测定,结果阴性对照品溶液在盐酸小檗碱保留时间处无色谱峰出现(见图l),表明该实验条件下,其他药材成分对测定无干扰。
图l 对照品及样品的HPLC图谱
1-对照品;2-阴性样品(缺黄柏);3-大补阴丸样品
2.6稳定性实验取样品按2.3项下方法制备供试品溶液,在0、3、6、9、12h进样检测,测得结果RSD为1.03%,表明样品溶液在12h内基本稳定。
2.7重复性实验取同一样品5份按2.3项下方法制得供试品溶液,依法进样检测,分别测定含量,RSD为0.92%。
2.8精密度实验取实验用对照品溶液,分别连续进样5次,RSD为0.32%。结果表明仪器运行良好。
2.9加样回收率实验精密称取已知含量的供试品(批号20080607)1g,共6份,分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品溶液,依法提取测定。
2.10样品测定取二个厂家样品4批,制成供试品溶液,分别测定吸收峰面积,按外标法计算盐酸小檗碱含量,结果如下
样品含量测定结果(n=3)
厂家产地 批号 含量(mg/g) RSD(%)
福建 20080607 3.21 0.65
20080712 2.57 1.17
20071204 3.84 0.73
陕西 071208 1.07 0.54
3讨论
3.1通过含量测定结果可见厂家及各批号的产品间的含量存在差异,这可能与原料药有关;在旧版药典中黄柏与关黄柏合并做为黄柏使用,新版药典中才分列使用,而二者的含量差别悬殊,市场上混用比较严重,成方制剂中有必要增加对其含量的考察。
3.2经比较索氏回流提取法比超声波提取法含量高,而且所测定的目标成分为有色物质,以回流液无色作为提取终点,有利于判断,实验证明,该法提取完全,回收率较好。
3.3试验采用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂,能与目标成分结合形成离子对,从而减少硅醇基的影响。经实验证明,离子对试剂的使用,有助改善组分的分离。
参考文献
[1] 国家药典委员会编.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005:214-329.
【关键词】大补阴丸;盐酸小檗碱;高效液相色谱法
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)14-039-1
大补阴丸由熟地黄、盐黄柏、盐知母、龟甲、猪脊髓五味药物组成,具有滋阴降火的功效,用于阴虚火旺、潮热盗汗、咳嗽咯血、耳鸣遗精等症。方中盐黄柏具有滋阴降火的功效,用于阴虚火旺、盗汗骨蒸等症;其主要成分为盐酸小檗碱,现采用高效液相色谱法测定大补阴丸中盐酸小檗碱的含量来确定制剂中盐黄柏的含量,方法简便,结果准确可靠,可用于大补阴丸的质量控制。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent1100系列高效液相色谱仪(包括四元梯度泵;紫外检测器;Agilent工作站)BP211D电子分析天平(Sartorius)。
1.2试药盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号0713-200608)甲醇为色谱,纯水为超纯水;其他试剂均为分析纯;大补阴丸为市售。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱:Phenomenex C18色谱柱(250mm×4.6mm,4μm);流动相为磷酸盐缓冲液[0.05mol/L磷酸二氢钾溶液和0.05mol/L十二烷基磺酸钠溶液(1:1)]-甲醇(70:30);流速:1.0ml/min;检测波长265nm,柱温为30℃;进样量;10µl;理论板数按盐酸小檗碱峰计算,应不低于4000。色谱图见图1。
2.2对照品溶液制备精密称取盐酸小檗碱对照品10.18mg,置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成每ml含101.8µg的溶液,作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1.3.5.10.15.20ml置50mL量瓶中,加甲醇制成浓度为2.036,6.108,10.18,20.36,30.54,40.72µg/ml的对照品系列浓度溶液,即得。
2.3供试品溶液的制备取本品(水蜜丸)适量,研细,取1g精密称定,置索氏提取器中精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液适量,加热回流提取至提取液无色,将提取液移至100ml量瓶中,用少量上述混合溶液洗涤容器,洗液并入同一量瓶中,加上述混合液至刻度,摇匀,精密量取5ml至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,作为供试品溶液。
2.4线性关系考察取2.2项下对照品系列浓度溶液,按2.1色谱条件进行测定,测得峰面积,以浓度(C)对峰面积(A)积分值进行线性回归,求得回归方程为A=48.237C+0.8431,r=0.9995。表明盐酸小檗碱在2.036-40.72µg/ml浓度范围内,线性良好。
2.5空白实验按照中国药典2005年版处方比例及制法制成不含黄柏的样品,并按供试品的制法制成阴性对照溶液,依法进行测定,结果阴性对照品溶液在盐酸小檗碱保留时间处无色谱峰出现(见图l),表明该实验条件下,其他药材成分对测定无干扰。
图l 对照品及样品的HPLC图谱
1-对照品;2-阴性样品(缺黄柏);3-大补阴丸样品
2.6稳定性实验取样品按2.3项下方法制备供试品溶液,在0、3、6、9、12h进样检测,测得结果RSD为1.03%,表明样品溶液在12h内基本稳定。
2.7重复性实验取同一样品5份按2.3项下方法制得供试品溶液,依法进样检测,分别测定含量,RSD为0.92%。
2.8精密度实验取实验用对照品溶液,分别连续进样5次,RSD为0.32%。结果表明仪器运行良好。
2.9加样回收率实验精密称取已知含量的供试品(批号20080607)1g,共6份,分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品溶液,依法提取测定。
2.10样品测定取二个厂家样品4批,制成供试品溶液,分别测定吸收峰面积,按外标法计算盐酸小檗碱含量,结果如下
样品含量测定结果(n=3)
厂家产地 批号 含量(mg/g) RSD(%)
福建 20080607 3.21 0.65
20080712 2.57 1.17
20071204 3.84 0.73
陕西 071208 1.07 0.54
3讨论
3.1通过含量测定结果可见厂家及各批号的产品间的含量存在差异,这可能与原料药有关;在旧版药典中黄柏与关黄柏合并做为黄柏使用,新版药典中才分列使用,而二者的含量差别悬殊,市场上混用比较严重,成方制剂中有必要增加对其含量的考察。
3.2经比较索氏回流提取法比超声波提取法含量高,而且所测定的目标成分为有色物质,以回流液无色作为提取终点,有利于判断,实验证明,该法提取完全,回收率较好。
3.3试验采用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂,能与目标成分结合形成离子对,从而减少硅醇基的影响。经实验证明,离子对试剂的使用,有助改善组分的分离。
参考文献
[1] 国家药典委员会编.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005:214-329.