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【摘要】目的：测定复方酮康唑乳膏中硫酸新霉素的含量。方法：用2,4－二硝基氟苯作柱前衍生剂，乙腈－三乙胺溶液（pH3.6）（80∶20）为流动相，检测波长为365nm。结果：测定线性范围12.5～200μg/ml［Y＝17582.8X＋42140，r=0.9995(n=5)］平均回收率为99.7%，RSD＝1.39%（n=6）。结论：本法操作简单、快速、灵敏度高。
【关键词】复方酮康唑乳膏 硫酸新霉素 2,4－二硝基氟苯 HPLC
Pre-column-HPLC method derived compound ketoconazole cream in sulfuric acid content of neomycin
LiPu
【Abstract】Objective: To determine the compound ketoconazole cream in the content of neomycin sulfate. Methods: 2,4 - dinitrofluorobenzene for pre-column derivative agent, acetonitrile - triethylamine solution (pH3.6) (80:20) as mobile phase and detection at 365nm. Results: The determination of linear range 12.5 ~ 200μg/ml ［Y = 17582.8X +42140, r = 0.9995 (n = 5)］ and the average recovery was 99.7%, RSD = 1.39% (n = 6). Conclusion: The method is simple, rapid and sensitive.
【Key words】Compound ketoconazole creamNeomycin sulfate2,4 – dinitrofluorobenzeneHPLC
复方酮康唑乳膏主要用于皮肤浅表真菌染，对手、足、体、股癣有较好的疗效，在OTC用药中有较大的销量，《中国药典》2005年版收载了该品种［1］，其中硫酸新霉素含量测定仍使用微生物检定法，该法操作繁琐，且需时较长，重现性较差［2］，采用高效液相法测定，但硫酸新霉素在紫外区无特征吸收，故经衍生化，本文采用2,4－二硝基苯（DNFB）［3、4、5］作衍生剂，对复方酮康唑乳膏中硫酸新霉素进行了含量测定。
1仪器与试剂
岛津LC－10AP高效液相色谱仪，SPD－10AP紫外检测器，大连色谱工作站。新霉素标准品（批号：3099310）由中国药品生物制品检定所提供，2,4－二硝基氟苯（江阴暨阳医药化工有限公司）, 复方酮康唑乳膏（武汉诺安药业有限公司,批号：2007091）；乙腈为色谱纯，其他为分析纯。
2实验方法与结果
2.1色谱条件:色谱柱：Hypersil ODS C18柱（5μm，4.6mm×150mm）；流动相：乙腈－三乙胺溶液（量取三乙胺3ml，加水800ml，用磷酸调pH值到3.6）（80∶20）；0.8ml/min；柱温38℃；检测波长为365nm,色谱图见图1。
2.2线性关系:精密称取新霉素标准品100mg，置50ml量瓶中，加含3%氯化钠的磷酸盐缓冲液（pH7.8）适量，使溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取适量，分别加上述缓冲液稀释成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml 5种浓度的溶液。精密量取此5种溶液，分别置50ml量瓶中，各加2,4－二硝氟苯溶液（取2,4－二硝基氟苯0.5g，加无水乙醇50溶解，即得）10ml与三羟甲基氨基甲烷溶液（取三羟甲基氨基甲烷约0.3g，置100ml量瓶中，加水20ml溶解，再用二甲基亚砜稀释到刻度，摇匀，即得）10ml，摇匀。密塞，置60℃水浴中加热50分钟，取出放置10分钟，加乙腈适量，冷却到室温，用乙腈稀释到刻度，摇匀。分别吸取20μl注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积Y对浓度X进行线性回归，得线性方程为Y＝17582.8X＋42140，r=0.9995(n=5)，结果表明新霉素在12.5～200.0μg/ml范围内呈良好线性关系。
2.3样品测定方法
2.3.1对照品溶液的制备:精密量取线性关系项下的对照品储备液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释到刻度，摇匀。
2.3.2供试品溶液的制备:精密量称取复方酮康唑乳膏4g（约相当于新霉素20mg），置100ml具塞锥形瓶中，加石油醚（沸程90℃-120℃）50ml，超声处理约30分钟，使基质溶解后，转移到分液漏斗中，用含3%氯化钠的磷酸盐缓冲液（pH7.8）提取4次，每次20ml，合并提取液，置100ml量瓶中，加上述缓冲液稀释至刻度［1］，摇匀，即成。
3.3测定:精密量取供试品溶液与对照品溶液各5.0ml，分别置50ml量瓶中，各加2,4－二硝基氟苯溶液10ml与三羟甲基氨基甲烷溶液10ml，摇匀，密塞，置60℃水浴中加热50分钟，取出放置10分钟，加乙腈适量，冷却到室温，用乙腈稀释到刻度，摇匀。分别吸取20μl注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算含量，即得。结果见下表。
2.4适用性试验
2.4.1加样回收率试验:精密量取样品测定项下的供试品溶液10ml，置25ml量瓶中，再精密量取样品测定项下的对照品溶液10 ml、15 ml、20 ml，混合均匀，精密量取混合液5.0ml，照样测定项下的方法，自“分别置50ml量瓶中”起，依法测定，测得回收率分别为99.0%、101.3%、98.8%，平均回收率为99.7%，RSD＝1.39%。
2.4.2精密度试验:精密吸取对照品溶液5ml，按样品测定方法测定，连续进样5次，结果RSD为1.48%。
2.4.3稳定性试验：按含量测定项下的方法，对同一批样品，重复进样5次，色谱峰面积的RSD为1.82%(n=5)，被测溶液分别放置1、2、4、8、16、24小时再进行测定，结果没有变化。
2.4.4与药典标准比较
结果表明与药典标准方法一致，没有差异。
3讨论
3.1本法试剂存在有峰吸收，为前峰，出峰时间在3－4分钟，样品峰出峰时间在8－10钟，样品峰与试剂峰能很好分离。
3.2新霉素B与新霉素C很好地分离。
3.3处方中酮康唑、丙酸氯倍他索在该检测波长下无吸收，不干扰测定。
3.4本法与药典标准方法一致，但简单灵敏，适合于复方酮康唑乳膏中硫酸新霉素含量测定。参考文献
1中华人民和国药典2005年版二部，436
2苏健.复方酮康唑乳膏中新霉素含量测定方法探讨，西北药学杂志2002,17（3）：104
3陈蓉等.HPLC柱前衍生法测定复方新霉素滴耳液中新霉素的含量，中国药品标准，2004，（3）：48
4余江南等.两种RP－HPLC柱前衍生法快速测定核糖霉素方法的建立与比较，中国药科大学学报，1996,（1）：27
5杨美成等.柱前衍生化HPLC法测定硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的含量，中国临床药杂志2004，13（5）：288－291
作者单位：416000湖南省湘西州药品检验所
【关键词】复方酮康唑乳膏 硫酸新霉素 2,4－二硝基氟苯 HPLC
Pre-column-HPLC method derived compound ketoconazole cream in sulfuric acid content of neomycin
LiPu
【Abstract】Objective: To determine the compound ketoconazole cream in the content of neomycin sulfate. Methods: 2,4 - dinitrofluorobenzene for pre-column derivative agent, acetonitrile - triethylamine solution (pH3.6) (80:20) as mobile phase and detection at 365nm. Results: The determination of linear range 12.5 ~ 200μg/ml ［Y = 17582.8X +42140, r = 0.9995 (n = 5)］ and the average recovery was 99.7%, RSD = 1.39% (n = 6). Conclusion: The method is simple, rapid and sensitive.
【Key words】Compound ketoconazole creamNeomycin sulfate2,4 – dinitrofluorobenzeneHPLC
复方酮康唑乳膏主要用于皮肤浅表真菌染，对手、足、体、股癣有较好的疗效，在OTC用药中有较大的销量，《中国药典》2005年版收载了该品种［1］，其中硫酸新霉素含量测定仍使用微生物检定法，该法操作繁琐，且需时较长，重现性较差［2］，采用高效液相法测定，但硫酸新霉素在紫外区无特征吸收，故经衍生化，本文采用2,4－二硝基苯（DNFB）［3、4、5］作衍生剂，对复方酮康唑乳膏中硫酸新霉素进行了含量测定。
1仪器与试剂
岛津LC－10AP高效液相色谱仪，SPD－10AP紫外检测器，大连色谱工作站。新霉素标准品（批号：3099310）由中国药品生物制品检定所提供，2,4－二硝基氟苯（江阴暨阳医药化工有限公司）, 复方酮康唑乳膏（武汉诺安药业有限公司,批号：2007091）；乙腈为色谱纯，其他为分析纯。
2实验方法与结果
2.1色谱条件:色谱柱：Hypersil ODS C18柱（5μm，4.6mm×150mm）；流动相：乙腈－三乙胺溶液（量取三乙胺3ml，加水800ml，用磷酸调pH值到3.6）（80∶20）；0.8ml/min；柱温38℃；检测波长为365nm,色谱图见图1。
2.2线性关系:精密称取新霉素标准品100mg，置50ml量瓶中，加含3%氯化钠的磷酸盐缓冲液（pH7.8）适量，使溶解并稀释到刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取适量，分别加上述缓冲液稀释成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml 5种浓度的溶液。精密量取此5种溶液，分别置50ml量瓶中，各加2,4－二硝氟苯溶液（取2,4－二硝基氟苯0.5g，加无水乙醇50溶解，即得）10ml与三羟甲基氨基甲烷溶液（取三羟甲基氨基甲烷约0.3g，置100ml量瓶中，加水20ml溶解，再用二甲基亚砜稀释到刻度，摇匀，即得）10ml，摇匀。密塞，置60℃水浴中加热50分钟，取出放置10分钟，加乙腈适量，冷却到室温，用乙腈稀释到刻度，摇匀。分别吸取20μl注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积Y对浓度X进行线性回归，得线性方程为Y＝17582.8X＋42140，r=0.9995(n=5)，结果表明新霉素在12.5～200.0μg/ml范围内呈良好线性关系。
2.3样品测定方法
2.3.1对照品溶液的制备:精密量取线性关系项下的对照品储备液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释到刻度，摇匀。
2.3.2供试品溶液的制备:精密量称取复方酮康唑乳膏4g（约相当于新霉素20mg），置100ml具塞锥形瓶中，加石油醚（沸程90℃-120℃）50ml，超声处理约30分钟，使基质溶解后，转移到分液漏斗中，用含3%氯化钠的磷酸盐缓冲液（pH7.8）提取4次，每次20ml，合并提取液，置100ml量瓶中，加上述缓冲液稀释至刻度［1］，摇匀，即成。
3.3测定:精密量取供试品溶液与对照品溶液各5.0ml，分别置50ml量瓶中，各加2,4－二硝基氟苯溶液10ml与三羟甲基氨基甲烷溶液10ml，摇匀，密塞，置60℃水浴中加热50分钟，取出放置10分钟，加乙腈适量，冷却到室温，用乙腈稀释到刻度，摇匀。分别吸取20μl注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算含量，即得。结果见下表。
2.4适用性试验
2.4.1加样回收率试验:精密量取样品测定项下的供试品溶液10ml，置25ml量瓶中，再精密量取样品测定项下的对照品溶液10 ml、15 ml、20 ml，混合均匀，精密量取混合液5.0ml，照样测定项下的方法，自“分别置50ml量瓶中”起，依法测定，测得回收率分别为99.0%、101.3%、98.8%，平均回收率为99.7%，RSD＝1.39%。
2.4.2精密度试验:精密吸取对照品溶液5ml，按样品测定方法测定，连续进样5次，结果RSD为1.48%。
2.4.3稳定性试验：按含量测定项下的方法，对同一批样品，重复进样5次，色谱峰面积的RSD为1.82%(n=5)，被测溶液分别放置1、2、4、8、16、24小时再进行测定，结果没有变化。
2.4.4与药典标准比较
结果表明与药典标准方法一致，没有差异。
3讨论
3.1本法试剂存在有峰吸收，为前峰，出峰时间在3－4分钟，样品峰出峰时间在8－10钟，样品峰与试剂峰能很好分离。
3.2新霉素B与新霉素C很好地分离。
3.3处方中酮康唑、丙酸氯倍他索在该检测波长下无吸收，不干扰测定。
3.4本法与药典标准方法一致，但简单灵敏，适合于复方酮康唑乳膏中硫酸新霉素含量测定。参考文献
1中华人民和国药典2005年版二部，436
2苏健.复方酮康唑乳膏中新霉素含量测定方法探讨，西北药学杂志2002,17（3）：104
3陈蓉等.HPLC柱前衍生法测定复方新霉素滴耳液中新霉素的含量，中国药品标准，2004，（3）：48
4余江南等.两种RP－HPLC柱前衍生法快速测定核糖霉素方法的建立与比较，中国药科大学学报，1996,（1）：27
5杨美成等.柱前衍生化HPLC法测定硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的含量，中国临床药杂志2004，13（5）：288－291
作者单位：416000湖南省湘西州药品检验所