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摘要：【目的】探讨冬季低温环境下莴笋叶片花青素积累对光合作用的影响及作用机理，以期为莴笋栽培和品种选育提供参考依据。【方法】分别于常温季（10月中旬）、冬季低温初期（11月底—12月初）、中期（翌年1月中旬）和末期（翌年2月上旬）在广西大学试验基地活体监测莴笋叶片叶绿素荧光和光合气体交换特性，采用分光光度法测定过氧化氢（H2O2）浓度、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性和花青素含量。【结果】与常温季相比，低温初期葉片凌晨最大光化学效率值（Fv/Fm）略降，基底荧光（Fo）略增，相对电子传递速率（ETR）下降8.9%，光化学耗散（qP）、光化学途径能耗效率占比[Y（Ⅱ）]和稳态净光合速率（Pn）略降，最大净光合速率（Pmax）则下降3.59 ?mol/（m2·s）;SOD和POD活性分别增加5倍和1倍，CAT活性降低31%;H2O2和花青素含量分别增加81%和9倍。到低温中期时，Fv/Fm升至0.85，Fo、ETR、Y（II）、Pn和Pmax回升至略高于常温季水平;SOD和CAT活性较初期增加1倍;H2O2含量略降，花青素含量增至初期的7倍。末期天气转暖时，Fv/Fm降至0.77，Fo上升到接近0.10的峰值，组成型能量耗散率[Y（NO）]占比高达34%，ETR、Pn和Pmax比中期分别降低22%、28%和33%;尽管SOD、POD和CAT活性在中期的基础上分别增加178%、28%和36%，而H2O2含量依然剧增1.36倍;花青素含量上翻了3倍。相关分析的结果表明，花青素含量、SOD活性和H2O2含量两两间呈显著正相关（P<0.05），而花青素、H2O2含量和光合速率之间相关性均不显著（P>0.05），光合速率是多因素综合作用的结果。【结论】与单独低温作用相比，低温和强光共同作用下莴笋叶片合成更多花青素，通过增加叶片温度、调节叶片能量平衡及与抗氧化系统共同作用等方式起光保护作用，为低温下光合机构功能维持及良性运转提供支撑。
关键词： 莴笋叶片;低温;光抑制;光诱导;花青素;叶绿素荧光特性
中图分类号： S636.2 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）01-0180-09
Abstract：【Objective】To investigate the effects of anthocyanin accumulation on photosynthesis and its mechanism in the asparagus lettuce leaves at low temperature in winter， and provide reference basis for asparagus lettuce cultivation and breeding. 【Method】The seedlings grown in the experimental field in Guangxi University were taken as test materials， and the chlorophyll fluorescence， photosynthetic gas exchange characteristics were measured on the living plants in the field at the normal temperature season（middle October）， the early chill season（late November-early December）， middle chill season（middle January in next year） and late chill season（early February in next year） in winter respectively， and then， the sample leaves were taken back to laboratory. Hydrogen peroxide（H2O2） concentration， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT） activities and anthocyanin contents were determined by spectrophotometry in those leaves. 【Result】Compared with the normal temperature season， predawn maximal photochemical efficiency of PSⅡ（Fv/Fm） value in asparagus lettuce leaves decreased， and the ground fluorescence（Fo） value increased slightly at the early-chill season. At the same time， the apparent photosynthetic electron transport rate（ETR） value decreased by 8.9%， and the photochemical quenching coefficient（qP）， actual PSII photochemical efficiency[Y（Ⅱ）]， stable net photosynthetic rate（Pn） values were decreased slightly， and the maxim photosynthesis rate（Pmax） decreased by 3.59 ?mol/（m2·s）. SOD and POD activity increased by 5 times and once respectively， yet CAT activity decreased by 31%. H2O2 and anthocyanin contents increased by 81% and 9 times respectively at this period. During the middle chill season， Fv/Fm value increased to 0.85， Fo， ETR， Y（II）， Pn and Pmax values also increased to be slightly higher than that at the normal temperature season. SOD and CAT activities increased by one time， and H2O2 content was slightly decreased， however， anthocyanin contents raised by 7 times compared with early stage. At the end of the chill season， with the warming up of the weather， Fv/Fm value decreased to 0.77. Both Fo （0.1） and the non-regulatory energy dissipation Y（NO）（34%） value raised to the highest level. The values of ETR， Pn and Pmax decreased by 22%，28% and 33%. Although SOD， POD and CAT activity increased by 178%， 28% and 36%， H2O2 concentration increased by 1.36 times of that at the middle chill season. Anthocyanin concentration also increased by 3 times of that at the middle chill season. Across the normal and the chill season， anthocyanin contents had significant positive correlation with H2O2 concentrations，and H2O2 concentrations had positive correlation with SOD activities（P<0.05）. Moreover， there were no significant positive correlations between Pn values and anthocyanin contents and H2O2 concentrations（P>0.05）. Pn was affected by multiple factors. 【Conclusion】The combined effects of low temperature with strong light synthetize more anthocyanin in asparagus lettuce leaves compared with low temperature alone. It maintains the photosynthetic apparatus running in its right track through increasing leaf temperature， regulating energy balance and increasing antioxidant ability under the chilling stress， which provides support for maintenance and functio-ning of photosynthetic apparatus under low temperature. Key words： asparagus lettuce leaves; low temperature; photoinhibition; photoinduction; anthocyanin; chlorophyll fluorescence characteristics
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860109）
0 引言
【研究意义】莴笋（Lactuca sativa L.）是一年或二年生的菊科莴苣属（Lactuca L.）植物，别称莴苣、莴苣笋、香笋等（袁庆军和杨昌煦，2002），其组织含有丰富的蛋白质、脂类物质、碳水化合物、维生素（如尼克酸）和矿质元素（如铁、锌）等多种营养成分（高天啟，2018），同时还具有良好的保健功效，对改善糖代谢、镇痛及刺激消化、分解亚硝胺等有良好的作用（戴国辉等，2008）。莴笋广布于我国31个省（市、自治区），是各地菜市的保障性蔬菜。南方地区莴笋常常在11月—次年4月（尤其是春节前后）大量上市，而这段时期的低温天气对其品质有较大负面影响。花青素是类黄酮类的天然植物色素，常常在逆境条件下以碳水化合物为底物应急合成，对植物起光保护作用（Steyn et al.，2002）。研究低温条件下花青素对莴笋的光保护效果和作用机理，可为莴笋低温栽培管理和抗低温育种提供理论依据。【前人研究进展】1999年，Smillie和Hetherington首次充分论证了花青素的光保护功能，此后多学科（如化学、农学、环境科学）研究者纷纷加入花青素光保护研究阵营（Steyn et al.，2002;Agati and Tattini，2010）。Zhang等（2010）研究得出，植物组织表层的花青素可以反射部分光能，减轻强光对植物叶片的伤害。Hughes（2011）研究发现，叶片表皮的花青素可以屏蔽部分过剩光能，从而对叶片内部组织起光保护作用。此外，有报道证实花青素可以有效清除叶片自由基，起抗氧化保护作用（Agati and Tattini，2010）。近年来，有报道逆境（如低温）条件下花青素对氮素的调节和再分配作用（Tanaka et al.，2014）。随着研究对象的扩展，研究结果表明部分植物叶片表层的花青素虽然可以吸收一定波长的自然光，主要是红光（Hughes et al.，2007;An et al.，2020），但花青素吸收和反射的光量占植物叶片总吸收光量的比例很小（Gould et al.，1995;Pietrini et al.，2002），光保护作用有限。花青素的光保护机制有待在更多的植物和更广泛的环境条件下展开更深入的研究。【本研究切入点】本课题组已经在多种植物中研究了花青素的生物学功能，了解到部分莴笋品种在低温期间更易于合成花青素，而花青素对莴笋光合作用的影响目前鲜有报道，其作用机制更不清楚。【拟解决的关键问题】以大田种植的莴笋为材料，从低温来临前的常温季节至低温天气结束开始转暖止，连续监测叶片光合特性、花青素含量及关键抗氧化物质的变化动态，分析其相互关系，揭示低温下花青素积累对莴笋光合特性的影响及其作用机理，为莴笋生产提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验设计
将33 g市售莴笋种子平均分成3份，于2019年8月1日播种于广西大学试验基地3个小地块中，每地块3.3 m2。间苗定苗后，每一地块保留40株以上，按尿素225 kg/ha、硝酸钾300 kg/ha追肥一次，常规管理。分别于2019年的10月10—12日（常温季）、1月29日—12月1日（低温初期）及2020年的1月10—12日（低温中期）、2月7—10日（低温末期）监测叶片光合参数，并取样测定生理指标。
1. 2 试验温度和光照条件
如表1所示，常温季白天气温28.0 ℃左右，叶温较之高出3.0 ℃左右。昼夜温差较大，夜温比白天低7.0 ℃左右;至低温初期，昼夜温度比常温季下降近一半，温差缩小，叶温比气温高3.5 ℃左右;低温中期，昼夜温度比低温初期各自下降近5.0 ℃，但叶温只降了2.5 ℃左右;低温末期，白天气温回升到近低温初期水平，而夜温比初期高了1.0 ℃，叶温比初期也增加1.0 ℃。常温季光量子通量密度（PPFD）最高，接近2000.0 ?mol/（m2·s）;低温初期显著下降至1800.0 ?mol/（m2·s）左右（P<0.05，下同）;低温中期最低，低温末期则大幅显著回升，介于常温季和低温初期之间。
1. 3 指标测定及方法
1. 3. 1 叶片叶绿素荧光参数测定 各地块选取无明显病虫害、长势中等的莴笋各4株，再从每株茎杆中上部选出3～4片健康叶挂牌标记。于凌晨天亮前，用调制叶绿素荧光成像系统仪IMAGING-PAM MINI-版（Walz公司，德国）监测基底荧光（Fo）和最大荧光（Fm），仪器自动计算最大光化学效率值（Fv/Fm）;稍停片刻测定叶片吸光系数（Abs），用于后续计算相对电子传递速率（ETR）;然后用250 ?mol/（m2·s）活化蓝光诱导4.5 min，记录光化学能量耗散参数稳态荧光值（Ft）、光化学耗散（qP）、非光化学耗散（qN）、ETR、热耗散（NPQ）、光化学途径耗能率[Y（Ⅱ）]、非光化学途径耗能率[Y（NPQ）]和组成型能量耗散率[Y（NO）]等荧光参数值。最后测定ETR和NPQ的光响应曲线，设1500、1000、800、400、300、200、130、70、40、20和0 ?mol/（m2·s） 11个光梯度，每梯度持续3 min。
1. 3. 2 光合氣体交换参数的测定 测完荧光参数后，用铝箔将标记叶片套上暗置30 min，用两台LI-6400XT光合系统测定仪（Licor公司，美国）测定标记叶片的光诱导参数和光响应曲线。每5 s记录一个数据，直至净光合速率（Pn）达到稳态，诱导结束后再启动光响应曲线测定程序，设置1500、1000、800、500、300、200、100、80、40、20和0 ?mol/（m2·s）共12个光强（PPFD）梯度，每梯度至少维持3 min，光响应曲线特征参数用直角双曲线修正模型拟合，得到最大净光合速率（Pmax）、光饱和点、光补偿点、量子效率和光下暗呼吸速率（Rd）等参数。 1. 3. 3 花青素含量测定 将上述测定叶绿素荧光参数和光合气体交换参数的莴笋叶片用冷藏箱采收带回试验室，清水冲洗2遍，蒸馏水过1遍，立即风干。3个地块的植株叶片剪碎、各称取0.5 g，放入装有6 mL 6 mol/L的HCl∶H2O∶MeOH（7∶23∶70）试管中密封，4 ℃冰箱提取24 h后，波长530和653 nm处读取光吸收值（A530，A653），则花青素含量=A530-0.24A653（Murray and Hackett，1991）。
1. 3. 4 过氧化氢（H2O2）含量和抗氧化酶活性的测定 H2O2和抗氧化酶提取及含量（活性）参照Zhu等（2013）的方法，使用分光光度计（岛津UV-2501，日本）测定。
1. 4 统计分析
采用Excel 2016进行数据处理，SPSS 19.0进行差异显著性检验和相关性分析，Sigmaplot 14.0制图。
2 结果与分析
2. 1 莴笋叶片不同生长时段叶绿素荧光特性分析
如图1-A所示，低温初期Fv/Fm为0.81，略低于常温季（0.83），表明冬季初期低温对莴笋光合机构的影响较小，而随着温度进一步降低，到中期时，Fv/Fm值反而上升到0.85的最高值，表明这段时期莴笋的光合机构反而处于一种比较良好的状态。常温季与低温初期的Fv/Fm无显著差异（P>0.05，下同）。低温即将结束转暖期，Fv/Fm急剧下降至0.77，显著低于其他时段，表明叶片已经处于光抑制边缘。Fo值变化趋势与Fv/Fm类似（图1-B），低温初期较常温季上升0.02，显著高于常温季，到低温中期又回落到常温季水平，低温末期上升到最高值，显著高于前3个时期。上述结果进一步证实低温初期天气对莴笋叶片光合机构影响不大，中期反而状态更良好，但低温末期由冷转暖的急剧变化对光合机构的运转影响较明显。
由表2可知，低温初期Ft较常温季增加近15%，中期则下降18%，而末期急剧上升至最高值0.091。qN在整个生长季节的变化趋势与Ft变化趋势略有不同，低温初期比常温季增加0.018，中期继续上升至0.573，两者间无显著差异，末期下降至最低值0.369。qP变化趋势与qN相反，低温初期略低于常温季，中期降至最低，而末期上升到最高水平。ETR低温初期与常温季相比略微下降，中期上升到最高值，末期则急剧下降至最低值38.838 ?mol/（m2·s）。结果表明，不同生长时段的叶绿素荧光动力学参数变化趋势总体上与图1中光合机构能量利用是吻合的，即低温初期和中期光合机构的运转没有受到明显影响，但低温末期受到较强冲击。
由图2可知，常温季叶片Y（Ⅱ）占比为56%，低温初期略下降，中期略高于常温季，末期则急剧下降至48%;Y（NPQ）常温季占19%，低温初期升至22%，中期下降至17%，末期维持在18%;Y（NO）低温初期为24%，中期没有明显变化，但末期急剧升至34%。表明整个测定期间Y（Ⅱ）耗能始终是主要方式，整个生长季叶片光合机构保持相对稳定;Y（NPQ）各时期相对稳定表明温度变化对非光化学途径耗能影响较小;低温末期Y（NO）占比急剧增加说明此时期叶绿体结构和功能可能经过一定程度的调整。为证实上述推断，进一步考察ETR和NPQ随光强的变化。
如图3-A所示，低温初期ETR随光强的增加而增加，最大值超过200 ?mol/（m2·s）;进入低温中期后，虽然气温进一步下降，但ETR反而增加，最大值上升至250 ?mol/（m2·s）附近;而低温末期，最大ETR值急剧下降到150 ?mol/（m2·s）左右。总体看，低温季节中不同时段莴笋叶ETR变化趋势与图2中Y（Ⅱ）的变化趋势一致，进一步证实能量分配结果的可靠性。无论是常温还是低温季节，NPQ值随着光强的增加呈直线上升，低温末期直线斜率明显大于其他时期（图3-B），表明低温末期叶绿体确实有较强的能量压力。ETR和NPQ两个参数的光响应曲线特征再次印证了图1和图2的结果。
2. 2 不同生长时段莴笋叶片光合速率的光诱导曲线
如图4所示，不同生长时段Pn随时间变化均表现出典型的S形曲线，可能是由于前面监测荧光参数后，暗适应时间较短，光合机构并未完全终止光合反应（如部分光合酶依旧活跃），从诱导开始即有一定的正Pn值。其中，低温初期Pn诱导值随时间变化上升较快，最终稳态Pn稳定在12 ?mol/（m2·s）以上，较常温季略降;低温中期诱导初始Pn值较常温和低温初期变化更为平稳，随后则转入快速上升期，S形特征更为明显，最终稳态Pn超过14 ?mol/（m2·s）;低温末期气温转暖之际，诱导曲线和低温初期类似，而稳态Pn大幅降至10 ?mol/（m2·s）附近，和低温中期比，下降近30%。总体看，光诱导Pn和qP、Y（Ⅱ）、ETR的变化趋势一致，再次印证低温初、中期气温对莴笋光合作用影响不大，但末期受较大影响。
2. 3 不同生长时段莴笋叶片光响应曲线分析
如图5所示，低温初期叶片Pn随PPFD的变化表现出近似直角双曲线上升趋势，Pn最高值达13.4 ?mol/（m2·s），在高PPFD区依旧呈上升趋势，类似于C4植物;低温中期，Pn在高光区表现更突出，上升趋势更明显，Pn最高值上升至13.9 ?mol/（m2·s）附近;而到了低温末期，Pn对高PPFD变得较敏感，表现出典型C3植物的特征，Pn最高值也急剧下降至10.2 ?mol/（m2·s）附近。结果表明，低温中期的莴笋有最强的耐强光能力，低温末期则对强光较敏感。
由表3可知，与常温季相比，低温初期莴笋叶片Pmax下降3.59 ?mol/（m2·s），光飽和点下降122.93 ?mol/（m2·s），光补偿点下降4.00 ?mol/（m2·s），量子效率下降0.009;低温中期光合速率没有饱和现象，Pmax与常温季相比则上升0.73 ?mol/（m2·s），光补偿点下降4.60 ?mol/（m2·s），量子效率与常温季接近;低温末期的Pmax急剧下降，光饱和点也降至1148.94 ?mol/（m2·s），光补偿点则增至28.85 ?mol/（m2·s），量子效率下降45%。Rd在不同生长时期一直保持稳定，其范围在0.99～1.28 ?mol/（m2·s）。上述结果再次印证了莴笋叶光合气体交换能力在低温初期和中期的相对稳定，而低温末期剧烈变动。 2. 4 莴笋叶片不同生长时段花青素含量、H2O2含量、抗氧化酶活性变化及其相关性分析
常温季莴笋叶片花青素含量极微，低温初期增加9倍，但绝对量依然较低，在低温中期大幅提升，低温末期再次急剧增加，为低温中期的3倍，低温初期的21倍（图6-A）。表明花青素的积累不仅受温度的影响，光照可能也是一个重要因素（表1）。
常温季莴笋叶片含有少量H2O2（6.8 ?mol/gFW），低温初期增加81%，为12.3 ?mol/gFW，低温中期降至9.9 ?mol/gFW，低温末期又急剧增加至23.4 ?mol/gFW，比中期增加1.36倍（图6-D）。显然，H2O2含量的变化季节间比较复杂。
抗氧化酶不同生长时期的变化状况如图6-D～图6-F，超氧化物歧化酶（SOD）活性随着季节的推移不断增加，低温初期比常温季增加5倍，中期在初期的基础上又翻了1倍，低温末期在中期的基础上再增加178%，该结果表明SOD一直处于预警状态，对环境变化十分敏感。过氧化物酶（POD）活性变化趋势与SOD相似，低温初期比常温季增加1倍，但低温中期比初期只是略微增加，而低温末期在中期基础上增加28%。过氧化氢酶（CAT）活性变化与前2种酶有所不同，低温初期活性比常温季反而下降31%，但随后迅速增加，低温末期比中期增加36%。不同时段SOD、POD和CAT 3种酶活性的变化并非同向，可能不同抗氧化酶交替起保护作用。
贯通整个测定时期，3类抗氧化酶中只有SOD活性和H2O2含量呈显著的正相关关系，POD和CAT虽然是直接清除H2O2的抗氧化酶，但其活性与H2O2含量却无显著相关性（图6-D～图6-F），表明一些非酶类活性氧清除物质如花青素等也在起作用。进一步分析花青素含量和H2O2含量的相关性，两者间呈显著的线性正相关关系（图6-G），从侧面证实花青素参与了H2O2的清除活动。
2. 5 莴笋叶片不同生长时段花青素含量和Pmax的关系
如圖7-A和图7-B所示，跨越整个测定时期，莴笋叶片花青素含量和Pmax、稳态Pn间均无显著相关性，表明花青素含量和Pn间并非单一的同向变化。如前文所述，低温中期适当浓度的花青素对Pn是正效应，但低温即将结束转暖时期，高浓度花青素对Pn是负效应。此外，Pn除受温度和光照等环境因子直接影响外，还受叶绿体内活性氧（ROS，主要是H2O2）浓度、花青素浓度等影响。从统计分析的结果看，Pn和H2O2两者间也无显著相关性（图7-C）。因此，自然条件下，莴笋叶片光合速率是多因子综合作用的结果。
3 讨论
15 ℃及以下低温对一些热起源植物的生理活动已经有明显影响（Demmig-Adams and Adams，2018），而莴笋这类非热起源植物则相对耐寒，整个冬季光合作用表现较好。植物凌晨Fv/Fm是反映植物耐受逆境胁迫的重要指标，已广泛用于植物对低温、干旱及重金属污染等胁迫响应的研究之中，同时，其也是衡量植物遭受光抑制程度的重要指标，数十种健康陆生微管植物监测表明，凌晨Fv/Fm为0.832±0.004（Demmig-Adams and Adams，2018）。低温初期莴笋叶受到轻微的低温胁迫，低温中期反而比常温季表现更良好，而低温末期气温转暖时则濒临光抑制。莴笋叶内花青素的积累及与抗氧化系统的共同起作用，维持和保障了光合机构的正常运转。
3. 1 低温初、中期花青素合成对莴笋光合的影响及机制解析
与常温季相比，低温初期凌晨Fv/Fm略下降，而Fo增加，表明低温（可能还有光照的协同作用）对光合机构确实产生了一定的负面影响。此时，叶内合成了少量的花青素。有研究者指出，花青素的合成通常是植物对逆境胁迫的一种应激性响应，尤其是初春、初秋和初冬以及天气剧烈变动的时候（Steyn et al.，2002）。随着气温进一步下降，莴笋的光合效率并没有相应降低，反而表现更好，有些指标甚至超过了常温季，这种现象与冬小麦等其他耐冷植物类似（Savitch et al.，2002）。对此现象可多个角度理解：（1）温度虽然进一步下降，但降幅不是很大（5 ℃左右）。（2）花青素含量增加和与之相关联的抗氧化酶活性的增加起到光保护作用。植物花青素的低温光保护功能可以通过多种机制实现（Meng et al.，2014），其吸收光谱和叶绿素（尤其是叶绿素b）吸收光谱有部分重叠（Gitelson et al.，2001），并且大部分花青素分布在叶片表面（Steyn et al.，2002），太阳光到达叶绿体以前，被这些花青素吸收一部分，间接保护了低温（尤其是和强光同时胁迫）下的叶绿体。由于花青素不会覆盖气孔，光合气体交换能力并没有受到影响。同时，由于花青素浓度不高，吸收部分光能对光合碳同化影响不大。（3）花青素实际上还有增加叶片温度的作用（Hughes，2011），从6400-xt光合仪上可以清晰地看到，与低温初期相比，虽然低温中期气温明显下降了5 ℃左右，但叶片温度仅下降2 ℃左右。（4）受花青素和抗氧化物质影响，叶片光合碳同化能力增强，也消耗了叶绿体内部分光能，这可以从叶绿素荧光监测结果找到证据，光化学途径耗能在这一个时期占到最大比重。（5）莴笋叶片关键抗氧化酶SOD活性显著增强，该酶是植物抗氧化系统主体水—水循环的第一道防线，可清除叶绿体内过多的超氧阴离子（O[-2]·），避免了ROS连环反应引发的细胞毒害（Majumdar and Kar，2018）。SOD作为抗氧化系统的预警者，与花青素协同变化，为这段时期光合机构的良好运转提供了支撑。
3. 2 低温末期气温由冷转暖之际，花青素合成对莴笋光合的影响及机制解析
低温末期天气由冷转暖时刻对植物逆境抵御尤为关键，除了低温胁迫外，光照的急剧增加也是一个重要因素，低温和强光结合，其危害远比单一低温强烈（Demmig-Adams and Adams，2018），根本原因在于两者结合改变了叶片的能量平衡。南方地区大量研究和生产实践表明，一些冷敏感或者耐冷植物，在低温期间没有表现出明显的寒（冷）害，但是低温结束转暖时，受害症状就突现出来（如有些莴笋品种出现部分叶片边缘或上半部分发黑干枯现象），部分植物更甚直接枯萎死亡。植物长时间与低温抗争，通过细胞内部结构和生理代谢，已逐渐适应了低温环境，而气温忽然转暖，太阳辐射大幅增加，细胞代谢来不及调整，原生质体内尤其是叶绿体内能量骤然增加，导致ROS浓度大幅上升，如果叶绿体不能及时将这些剩余自由能耗散掉，并及时将ROS清除，细胞将面临死亡的危险（Demmig-Adams and Adams，2018）。低温末期，H2O2含量剧增至最高，Fo升到峰值，Fv/Fm降至最低，Pmax和Pn大幅下降，叶绿体濒临光抑制。从能量消耗的角度分析，Y（Ⅱ）较前2个时期明显下降，Y（NO）则明显增加，表明叶绿体确实有一个结构和功能的调整过程。叶绿体是半自主的细胞器，与细胞核有密切的信号和物质交流，尤其在胁迫条件下（Schnettger et al.，2010）。该阶段花青素含量增加到最高值，除了在叶片表面形成一道光屏蔽体外，还可起到反光（van den Berg et al.，2009）、渗透调节（Chen et al.，2015）和直接清除ROS（Hughes et al.，2007）等功能。花青素及前体物质清除ROS的能力比抗坏血酸等抗氧化物质强至少4倍以上（Hughes et al.，2007;Attanayake et al.，2019）。虽然这段时期所有抗氧化酶活性都达到最高值，H2O2含量依然居高不下，花青素含量增加极可能也是叶片抗氧化需求告急的结果。此外，逆境下植物花青素的积累常和细胞内其他物质代谢，如激素代谢（Loreti et al.，2008）、抗氧化物质代谢（Page et al.，2012;Zhu et al.，2013;Attanayake et al.，2019）、糖代谢（花青素的合成底物源头是糖类物质）（Lin et al.，2018）以及一些次生物质代谢（Irshad et al.，2018）交织在一起。本研究中花青素含量和抗氧化系统预警者SOD的协同变化从侧面反映出花青素的多重作用。 4 結论
在广西南宁的自然条件下，单一低温对莴笋光合作用影响轻微，但低温和强光共同作用时，莴笋的光合作用受到较大冲击，表现出明显的光抑制效应。花青素的增温、增强抗氧化能力和调节叶片光能分配及与之伴随的抗氧化系统活性上调等机制保障了光合机构在低温季的正常运转。
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（責任编辑 邓慧灵）
关键词： 莴笋叶片;低温;光抑制;光诱导;花青素;叶绿素荧光特性
中图分类号： S636.2 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）01-0180-09
Abstract：【Objective】To investigate the effects of anthocyanin accumulation on photosynthesis and its mechanism in the asparagus lettuce leaves at low temperature in winter， and provide reference basis for asparagus lettuce cultivation and breeding. 【Method】The seedlings grown in the experimental field in Guangxi University were taken as test materials， and the chlorophyll fluorescence， photosynthetic gas exchange characteristics were measured on the living plants in the field at the normal temperature season（middle October）， the early chill season（late November-early December）， middle chill season（middle January in next year） and late chill season（early February in next year） in winter respectively， and then， the sample leaves were taken back to laboratory. Hydrogen peroxide（H2O2） concentration， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT） activities and anthocyanin contents were determined by spectrophotometry in those leaves. 【Result】Compared with the normal temperature season， predawn maximal photochemical efficiency of PSⅡ（Fv/Fm） value in asparagus lettuce leaves decreased， and the ground fluorescence（Fo） value increased slightly at the early-chill season. At the same time， the apparent photosynthetic electron transport rate（ETR） value decreased by 8.9%， and the photochemical quenching coefficient（qP）， actual PSII photochemical efficiency[Y（Ⅱ）]， stable net photosynthetic rate（Pn） values were decreased slightly， and the maxim photosynthesis rate（Pmax） decreased by 3.59 ?mol/（m2·s）. SOD and POD activity increased by 5 times and once respectively， yet CAT activity decreased by 31%. H2O2 and anthocyanin contents increased by 81% and 9 times respectively at this period. During the middle chill season， Fv/Fm value increased to 0.85， Fo， ETR， Y（II）， Pn and Pmax values also increased to be slightly higher than that at the normal temperature season. SOD and CAT activities increased by one time， and H2O2 content was slightly decreased， however， anthocyanin contents raised by 7 times compared with early stage. At the end of the chill season， with the warming up of the weather， Fv/Fm value decreased to 0.77. Both Fo （0.1） and the non-regulatory energy dissipation Y（NO）（34%） value raised to the highest level. The values of ETR， Pn and Pmax decreased by 22%，28% and 33%. Although SOD， POD and CAT activity increased by 178%， 28% and 36%， H2O2 concentration increased by 1.36 times of that at the middle chill season. Anthocyanin concentration also increased by 3 times of that at the middle chill season. Across the normal and the chill season， anthocyanin contents had significant positive correlation with H2O2 concentrations，and H2O2 concentrations had positive correlation with SOD activities（P<0.05）. Moreover， there were no significant positive correlations between Pn values and anthocyanin contents and H2O2 concentrations（P>0.05）. Pn was affected by multiple factors. 【Conclusion】The combined effects of low temperature with strong light synthetize more anthocyanin in asparagus lettuce leaves compared with low temperature alone. It maintains the photosynthetic apparatus running in its right track through increasing leaf temperature， regulating energy balance and increasing antioxidant ability under the chilling stress， which provides support for maintenance and functio-ning of photosynthetic apparatus under low temperature. Key words： asparagus lettuce leaves; low temperature; photoinhibition; photoinduction; anthocyanin; chlorophyll fluorescence characteristics
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860109）
0 引言
【研究意义】莴笋（Lactuca sativa L.）是一年或二年生的菊科莴苣属（Lactuca L.）植物，别称莴苣、莴苣笋、香笋等（袁庆军和杨昌煦，2002），其组织含有丰富的蛋白质、脂类物质、碳水化合物、维生素（如尼克酸）和矿质元素（如铁、锌）等多种营养成分（高天啟，2018），同时还具有良好的保健功效，对改善糖代谢、镇痛及刺激消化、分解亚硝胺等有良好的作用（戴国辉等，2008）。莴笋广布于我国31个省（市、自治区），是各地菜市的保障性蔬菜。南方地区莴笋常常在11月—次年4月（尤其是春节前后）大量上市，而这段时期的低温天气对其品质有较大负面影响。花青素是类黄酮类的天然植物色素，常常在逆境条件下以碳水化合物为底物应急合成，对植物起光保护作用（Steyn et al.，2002）。研究低温条件下花青素对莴笋的光保护效果和作用机理，可为莴笋低温栽培管理和抗低温育种提供理论依据。【前人研究进展】1999年，Smillie和Hetherington首次充分论证了花青素的光保护功能，此后多学科（如化学、农学、环境科学）研究者纷纷加入花青素光保护研究阵营（Steyn et al.，2002;Agati and Tattini，2010）。Zhang等（2010）研究得出，植物组织表层的花青素可以反射部分光能，减轻强光对植物叶片的伤害。Hughes（2011）研究发现，叶片表皮的花青素可以屏蔽部分过剩光能，从而对叶片内部组织起光保护作用。此外，有报道证实花青素可以有效清除叶片自由基，起抗氧化保护作用（Agati and Tattini，2010）。近年来，有报道逆境（如低温）条件下花青素对氮素的调节和再分配作用（Tanaka et al.，2014）。随着研究对象的扩展，研究结果表明部分植物叶片表层的花青素虽然可以吸收一定波长的自然光，主要是红光（Hughes et al.，2007;An et al.，2020），但花青素吸收和反射的光量占植物叶片总吸收光量的比例很小（Gould et al.，1995;Pietrini et al.，2002），光保护作用有限。花青素的光保护机制有待在更多的植物和更广泛的环境条件下展开更深入的研究。【本研究切入点】本课题组已经在多种植物中研究了花青素的生物学功能，了解到部分莴笋品种在低温期间更易于合成花青素，而花青素对莴笋光合作用的影响目前鲜有报道，其作用机制更不清楚。【拟解决的关键问题】以大田种植的莴笋为材料，从低温来临前的常温季节至低温天气结束开始转暖止，连续监测叶片光合特性、花青素含量及关键抗氧化物质的变化动态，分析其相互关系，揭示低温下花青素积累对莴笋光合特性的影响及其作用机理，为莴笋生产提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验设计
将33 g市售莴笋种子平均分成3份，于2019年8月1日播种于广西大学试验基地3个小地块中，每地块3.3 m2。间苗定苗后，每一地块保留40株以上，按尿素225 kg/ha、硝酸钾300 kg/ha追肥一次，常规管理。分别于2019年的10月10—12日（常温季）、1月29日—12月1日（低温初期）及2020年的1月10—12日（低温中期）、2月7—10日（低温末期）监测叶片光合参数，并取样测定生理指标。
1. 2 试验温度和光照条件
如表1所示，常温季白天气温28.0 ℃左右，叶温较之高出3.0 ℃左右。昼夜温差较大，夜温比白天低7.0 ℃左右;至低温初期，昼夜温度比常温季下降近一半，温差缩小，叶温比气温高3.5 ℃左右;低温中期，昼夜温度比低温初期各自下降近5.0 ℃，但叶温只降了2.5 ℃左右;低温末期，白天气温回升到近低温初期水平，而夜温比初期高了1.0 ℃，叶温比初期也增加1.0 ℃。常温季光量子通量密度（PPFD）最高，接近2000.0 ?mol/（m2·s）;低温初期显著下降至1800.0 ?mol/（m2·s）左右（P<0.05，下同）;低温中期最低，低温末期则大幅显著回升，介于常温季和低温初期之间。
1. 3 指标测定及方法
1. 3. 1 叶片叶绿素荧光参数测定 各地块选取无明显病虫害、长势中等的莴笋各4株，再从每株茎杆中上部选出3～4片健康叶挂牌标记。于凌晨天亮前，用调制叶绿素荧光成像系统仪IMAGING-PAM MINI-版（Walz公司，德国）监测基底荧光（Fo）和最大荧光（Fm），仪器自动计算最大光化学效率值（Fv/Fm）;稍停片刻测定叶片吸光系数（Abs），用于后续计算相对电子传递速率（ETR）;然后用250 ?mol/（m2·s）活化蓝光诱导4.5 min，记录光化学能量耗散参数稳态荧光值（Ft）、光化学耗散（qP）、非光化学耗散（qN）、ETR、热耗散（NPQ）、光化学途径耗能率[Y（Ⅱ）]、非光化学途径耗能率[Y（NPQ）]和组成型能量耗散率[Y（NO）]等荧光参数值。最后测定ETR和NPQ的光响应曲线，设1500、1000、800、400、300、200、130、70、40、20和0 ?mol/（m2·s） 11个光梯度，每梯度持续3 min。
1. 3. 2 光合氣体交换参数的测定 测完荧光参数后，用铝箔将标记叶片套上暗置30 min，用两台LI-6400XT光合系统测定仪（Licor公司，美国）测定标记叶片的光诱导参数和光响应曲线。每5 s记录一个数据，直至净光合速率（Pn）达到稳态，诱导结束后再启动光响应曲线测定程序，设置1500、1000、800、500、300、200、100、80、40、20和0 ?mol/（m2·s）共12个光强（PPFD）梯度，每梯度至少维持3 min，光响应曲线特征参数用直角双曲线修正模型拟合，得到最大净光合速率（Pmax）、光饱和点、光补偿点、量子效率和光下暗呼吸速率（Rd）等参数。 1. 3. 3 花青素含量测定 将上述测定叶绿素荧光参数和光合气体交换参数的莴笋叶片用冷藏箱采收带回试验室，清水冲洗2遍，蒸馏水过1遍，立即风干。3个地块的植株叶片剪碎、各称取0.5 g，放入装有6 mL 6 mol/L的HCl∶H2O∶MeOH（7∶23∶70）试管中密封，4 ℃冰箱提取24 h后，波长530和653 nm处读取光吸收值（A530，A653），则花青素含量=A530-0.24A653（Murray and Hackett，1991）。
1. 3. 4 过氧化氢（H2O2）含量和抗氧化酶活性的测定 H2O2和抗氧化酶提取及含量（活性）参照Zhu等（2013）的方法，使用分光光度计（岛津UV-2501，日本）测定。
1. 4 统计分析
采用Excel 2016进行数据处理，SPSS 19.0进行差异显著性检验和相关性分析，Sigmaplot 14.0制图。
2 结果与分析
2. 1 莴笋叶片不同生长时段叶绿素荧光特性分析
如图1-A所示，低温初期Fv/Fm为0.81，略低于常温季（0.83），表明冬季初期低温对莴笋光合机构的影响较小，而随着温度进一步降低，到中期时，Fv/Fm值反而上升到0.85的最高值，表明这段时期莴笋的光合机构反而处于一种比较良好的状态。常温季与低温初期的Fv/Fm无显著差异（P>0.05，下同）。低温即将结束转暖期，Fv/Fm急剧下降至0.77，显著低于其他时段，表明叶片已经处于光抑制边缘。Fo值变化趋势与Fv/Fm类似（图1-B），低温初期较常温季上升0.02，显著高于常温季，到低温中期又回落到常温季水平，低温末期上升到最高值，显著高于前3个时期。上述结果进一步证实低温初期天气对莴笋叶片光合机构影响不大，中期反而状态更良好，但低温末期由冷转暖的急剧变化对光合机构的运转影响较明显。
由表2可知，低温初期Ft较常温季增加近15%，中期则下降18%，而末期急剧上升至最高值0.091。qN在整个生长季节的变化趋势与Ft变化趋势略有不同，低温初期比常温季增加0.018，中期继续上升至0.573，两者间无显著差异，末期下降至最低值0.369。qP变化趋势与qN相反，低温初期略低于常温季，中期降至最低，而末期上升到最高水平。ETR低温初期与常温季相比略微下降，中期上升到最高值，末期则急剧下降至最低值38.838 ?mol/（m2·s）。结果表明，不同生长时段的叶绿素荧光动力学参数变化趋势总体上与图1中光合机构能量利用是吻合的，即低温初期和中期光合机构的运转没有受到明显影响，但低温末期受到较强冲击。
由图2可知，常温季叶片Y（Ⅱ）占比为56%，低温初期略下降，中期略高于常温季，末期则急剧下降至48%;Y（NPQ）常温季占19%，低温初期升至22%，中期下降至17%，末期维持在18%;Y（NO）低温初期为24%，中期没有明显变化，但末期急剧升至34%。表明整个测定期间Y（Ⅱ）耗能始终是主要方式，整个生长季叶片光合机构保持相对稳定;Y（NPQ）各时期相对稳定表明温度变化对非光化学途径耗能影响较小;低温末期Y（NO）占比急剧增加说明此时期叶绿体结构和功能可能经过一定程度的调整。为证实上述推断，进一步考察ETR和NPQ随光强的变化。
如图3-A所示，低温初期ETR随光强的增加而增加，最大值超过200 ?mol/（m2·s）;进入低温中期后，虽然气温进一步下降，但ETR反而增加，最大值上升至250 ?mol/（m2·s）附近;而低温末期，最大ETR值急剧下降到150 ?mol/（m2·s）左右。总体看，低温季节中不同时段莴笋叶ETR变化趋势与图2中Y（Ⅱ）的变化趋势一致，进一步证实能量分配结果的可靠性。无论是常温还是低温季节，NPQ值随着光强的增加呈直线上升，低温末期直线斜率明显大于其他时期（图3-B），表明低温末期叶绿体确实有较强的能量压力。ETR和NPQ两个参数的光响应曲线特征再次印证了图1和图2的结果。
2. 2 不同生长时段莴笋叶片光合速率的光诱导曲线
如图4所示，不同生长时段Pn随时间变化均表现出典型的S形曲线，可能是由于前面监测荧光参数后，暗适应时间较短，光合机构并未完全终止光合反应（如部分光合酶依旧活跃），从诱导开始即有一定的正Pn值。其中，低温初期Pn诱导值随时间变化上升较快，最终稳态Pn稳定在12 ?mol/（m2·s）以上，较常温季略降;低温中期诱导初始Pn值较常温和低温初期变化更为平稳，随后则转入快速上升期，S形特征更为明显，最终稳态Pn超过14 ?mol/（m2·s）;低温末期气温转暖之际，诱导曲线和低温初期类似，而稳态Pn大幅降至10 ?mol/（m2·s）附近，和低温中期比，下降近30%。总体看，光诱导Pn和qP、Y（Ⅱ）、ETR的变化趋势一致，再次印证低温初、中期气温对莴笋光合作用影响不大，但末期受较大影响。
2. 3 不同生长时段莴笋叶片光响应曲线分析
如图5所示，低温初期叶片Pn随PPFD的变化表现出近似直角双曲线上升趋势，Pn最高值达13.4 ?mol/（m2·s），在高PPFD区依旧呈上升趋势，类似于C4植物;低温中期，Pn在高光区表现更突出，上升趋势更明显，Pn最高值上升至13.9 ?mol/（m2·s）附近;而到了低温末期，Pn对高PPFD变得较敏感，表现出典型C3植物的特征，Pn最高值也急剧下降至10.2 ?mol/（m2·s）附近。结果表明，低温中期的莴笋有最强的耐强光能力，低温末期则对强光较敏感。
由表3可知，与常温季相比，低温初期莴笋叶片Pmax下降3.59 ?mol/（m2·s），光飽和点下降122.93 ?mol/（m2·s），光补偿点下降4.00 ?mol/（m2·s），量子效率下降0.009;低温中期光合速率没有饱和现象，Pmax与常温季相比则上升0.73 ?mol/（m2·s），光补偿点下降4.60 ?mol/（m2·s），量子效率与常温季接近;低温末期的Pmax急剧下降，光饱和点也降至1148.94 ?mol/（m2·s），光补偿点则增至28.85 ?mol/（m2·s），量子效率下降45%。Rd在不同生长时期一直保持稳定，其范围在0.99～1.28 ?mol/（m2·s）。上述结果再次印证了莴笋叶光合气体交换能力在低温初期和中期的相对稳定，而低温末期剧烈变动。 2. 4 莴笋叶片不同生长时段花青素含量、H2O2含量、抗氧化酶活性变化及其相关性分析
常温季莴笋叶片花青素含量极微，低温初期增加9倍，但绝对量依然较低，在低温中期大幅提升，低温末期再次急剧增加，为低温中期的3倍，低温初期的21倍（图6-A）。表明花青素的积累不仅受温度的影响，光照可能也是一个重要因素（表1）。
常温季莴笋叶片含有少量H2O2（6.8 ?mol/gFW），低温初期增加81%，为12.3 ?mol/gFW，低温中期降至9.9 ?mol/gFW，低温末期又急剧增加至23.4 ?mol/gFW，比中期增加1.36倍（图6-D）。显然，H2O2含量的变化季节间比较复杂。
抗氧化酶不同生长时期的变化状况如图6-D～图6-F，超氧化物歧化酶（SOD）活性随着季节的推移不断增加，低温初期比常温季增加5倍，中期在初期的基础上又翻了1倍，低温末期在中期的基础上再增加178%，该结果表明SOD一直处于预警状态，对环境变化十分敏感。过氧化物酶（POD）活性变化趋势与SOD相似，低温初期比常温季增加1倍，但低温中期比初期只是略微增加，而低温末期在中期基础上增加28%。过氧化氢酶（CAT）活性变化与前2种酶有所不同，低温初期活性比常温季反而下降31%，但随后迅速增加，低温末期比中期增加36%。不同时段SOD、POD和CAT 3种酶活性的变化并非同向，可能不同抗氧化酶交替起保护作用。
贯通整个测定时期，3类抗氧化酶中只有SOD活性和H2O2含量呈显著的正相关关系，POD和CAT虽然是直接清除H2O2的抗氧化酶，但其活性与H2O2含量却无显著相关性（图6-D～图6-F），表明一些非酶类活性氧清除物质如花青素等也在起作用。进一步分析花青素含量和H2O2含量的相关性，两者间呈显著的线性正相关关系（图6-G），从侧面证实花青素参与了H2O2的清除活动。
2. 5 莴笋叶片不同生长时段花青素含量和Pmax的关系
如圖7-A和图7-B所示，跨越整个测定时期，莴笋叶片花青素含量和Pmax、稳态Pn间均无显著相关性，表明花青素含量和Pn间并非单一的同向变化。如前文所述，低温中期适当浓度的花青素对Pn是正效应，但低温即将结束转暖时期，高浓度花青素对Pn是负效应。此外，Pn除受温度和光照等环境因子直接影响外，还受叶绿体内活性氧（ROS，主要是H2O2）浓度、花青素浓度等影响。从统计分析的结果看，Pn和H2O2两者间也无显著相关性（图7-C）。因此，自然条件下，莴笋叶片光合速率是多因子综合作用的结果。
3 讨论
15 ℃及以下低温对一些热起源植物的生理活动已经有明显影响（Demmig-Adams and Adams，2018），而莴笋这类非热起源植物则相对耐寒，整个冬季光合作用表现较好。植物凌晨Fv/Fm是反映植物耐受逆境胁迫的重要指标，已广泛用于植物对低温、干旱及重金属污染等胁迫响应的研究之中，同时，其也是衡量植物遭受光抑制程度的重要指标，数十种健康陆生微管植物监测表明，凌晨Fv/Fm为0.832±0.004（Demmig-Adams and Adams，2018）。低温初期莴笋叶受到轻微的低温胁迫，低温中期反而比常温季表现更良好，而低温末期气温转暖时则濒临光抑制。莴笋叶内花青素的积累及与抗氧化系统的共同起作用，维持和保障了光合机构的正常运转。
3. 1 低温初、中期花青素合成对莴笋光合的影响及机制解析
与常温季相比，低温初期凌晨Fv/Fm略下降，而Fo增加，表明低温（可能还有光照的协同作用）对光合机构确实产生了一定的负面影响。此时，叶内合成了少量的花青素。有研究者指出，花青素的合成通常是植物对逆境胁迫的一种应激性响应，尤其是初春、初秋和初冬以及天气剧烈变动的时候（Steyn et al.，2002）。随着气温进一步下降，莴笋的光合效率并没有相应降低，反而表现更好，有些指标甚至超过了常温季，这种现象与冬小麦等其他耐冷植物类似（Savitch et al.，2002）。对此现象可多个角度理解：（1）温度虽然进一步下降，但降幅不是很大（5 ℃左右）。（2）花青素含量增加和与之相关联的抗氧化酶活性的增加起到光保护作用。植物花青素的低温光保护功能可以通过多种机制实现（Meng et al.，2014），其吸收光谱和叶绿素（尤其是叶绿素b）吸收光谱有部分重叠（Gitelson et al.，2001），并且大部分花青素分布在叶片表面（Steyn et al.，2002），太阳光到达叶绿体以前，被这些花青素吸收一部分，间接保护了低温（尤其是和强光同时胁迫）下的叶绿体。由于花青素不会覆盖气孔，光合气体交换能力并没有受到影响。同时，由于花青素浓度不高，吸收部分光能对光合碳同化影响不大。（3）花青素实际上还有增加叶片温度的作用（Hughes，2011），从6400-xt光合仪上可以清晰地看到，与低温初期相比，虽然低温中期气温明显下降了5 ℃左右，但叶片温度仅下降2 ℃左右。（4）受花青素和抗氧化物质影响，叶片光合碳同化能力增强，也消耗了叶绿体内部分光能，这可以从叶绿素荧光监测结果找到证据，光化学途径耗能在这一个时期占到最大比重。（5）莴笋叶片关键抗氧化酶SOD活性显著增强，该酶是植物抗氧化系统主体水—水循环的第一道防线，可清除叶绿体内过多的超氧阴离子（O[-2]·），避免了ROS连环反应引发的细胞毒害（Majumdar and Kar，2018）。SOD作为抗氧化系统的预警者，与花青素协同变化，为这段时期光合机构的良好运转提供了支撑。
3. 2 低温末期气温由冷转暖之际，花青素合成对莴笋光合的影响及机制解析
低温末期天气由冷转暖时刻对植物逆境抵御尤为关键，除了低温胁迫外，光照的急剧增加也是一个重要因素，低温和强光结合，其危害远比单一低温强烈（Demmig-Adams and Adams，2018），根本原因在于两者结合改变了叶片的能量平衡。南方地区大量研究和生产实践表明，一些冷敏感或者耐冷植物，在低温期间没有表现出明显的寒（冷）害，但是低温结束转暖时，受害症状就突现出来（如有些莴笋品种出现部分叶片边缘或上半部分发黑干枯现象），部分植物更甚直接枯萎死亡。植物长时间与低温抗争，通过细胞内部结构和生理代谢，已逐渐适应了低温环境，而气温忽然转暖，太阳辐射大幅增加，细胞代谢来不及调整，原生质体内尤其是叶绿体内能量骤然增加，导致ROS浓度大幅上升，如果叶绿体不能及时将这些剩余自由能耗散掉，并及时将ROS清除，细胞将面临死亡的危险（Demmig-Adams and Adams，2018）。低温末期，H2O2含量剧增至最高，Fo升到峰值，Fv/Fm降至最低，Pmax和Pn大幅下降，叶绿体濒临光抑制。从能量消耗的角度分析，Y（Ⅱ）较前2个时期明显下降，Y（NO）则明显增加，表明叶绿体确实有一个结构和功能的调整过程。叶绿体是半自主的细胞器，与细胞核有密切的信号和物质交流，尤其在胁迫条件下（Schnettger et al.，2010）。该阶段花青素含量增加到最高值，除了在叶片表面形成一道光屏蔽体外，还可起到反光（van den Berg et al.，2009）、渗透调节（Chen et al.，2015）和直接清除ROS（Hughes et al.，2007）等功能。花青素及前体物质清除ROS的能力比抗坏血酸等抗氧化物质强至少4倍以上（Hughes et al.，2007;Attanayake et al.，2019）。虽然这段时期所有抗氧化酶活性都达到最高值，H2O2含量依然居高不下，花青素含量增加极可能也是叶片抗氧化需求告急的结果。此外，逆境下植物花青素的积累常和细胞内其他物质代谢，如激素代谢（Loreti et al.，2008）、抗氧化物质代谢（Page et al.，2012;Zhu et al.，2013;Attanayake et al.，2019）、糖代谢（花青素的合成底物源头是糖类物质）（Lin et al.，2018）以及一些次生物质代谢（Irshad et al.，2018）交织在一起。本研究中花青素含量和抗氧化系统预警者SOD的协同变化从侧面反映出花青素的多重作用。 4 結论
在广西南宁的自然条件下，单一低温对莴笋光合作用影响轻微，但低温和强光共同作用时，莴笋的光合作用受到较大冲击，表现出明显的光抑制效应。花青素的增温、增强抗氧化能力和调节叶片光能分配及与之伴随的抗氧化系统活性上调等机制保障了光合机构在低温季的正常运转。
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（責任编辑 邓慧灵）