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摘 要：该文主要概述了壳聚糖降解酶及伽马辐射降解壳聚糖方面的研究。
关键词：伽马辐射；壳聚糖酶；壳聚糖
中图分类号 TQ929 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）22-37-02
1 壳聚糖降解酶及伽马辐射降解壳聚糖的研究
壳聚糖酶（chitosanase，EC 3.2.1.132），全名为壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶（chitosan-N-acetylglucosaminohydrolase），是一种对线性的壳聚糖具有水解专一性的酶。它是能分解壳聚糖的一种配糖类水解酶，根据酶的氨基酸序列的相似性，可将目前测得序列的壳聚糖酶分别归属糖苷水解酶5号、8号、46号、75号和80号（http：//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）[1]。根据底物专一性差别将壳聚糖酶进一步细分为4类，即壳聚糖酶Ⅰ、壳聚糖酶Ⅱ、壳聚糖酶Ⅲ和壳聚糖酶IV[2-3]，第一类酶可以水解 GlcN-GlcN键及GlcNAc-GlcN键；第二类酶只能水解GlcN-GlcN键；第三类酶既可水解GlcN-GlcN键，又可水解GlcN–ClcNAc；第四类酶可以水解GlcN-GlcN键，GlcN-GlcNAc键及GlcNAc-GlcN键（表1）。
表1 微生物分泌的壳聚糖酶的家族和亚属
[ Family 8 ＼& Family 46&80 ＼&Subclass II＼&Subclass III＼&Subclass I＼&Subclass IV＼&＼&＼&＼&＼&CMCase activity （+）＼&CMCase activity （-）＼&＼&Inverting mechanism＼&Bacillus sp.
No 7-M[4]＼&B.Circulans
WL-12[3]＼&B.Circulans
MH-K1[5]＼&Streptomyces
sp.N174[6]＼&Amycolatopsis.
sp.Cso-2[7]＼&]
注：-○-；葡萄糖胺残基（N-acetyl-β-D-glucosamine residue）；-●-；葡萄糖残基（D-glucosamine residue）。
壳聚糖酶被更广泛的分为外切酶和内切酶2种类型。内切型壳聚糖酶的作用以任意释放二聚体、三聚体、四聚体等低聚糖混合物为主，外切型的作用则从壳聚糖的非还原末端开始降解生成单糖/二糖残基—氨基葡萄糖[8]。
γ射线是一种电磁波，它具有能量较高，穿透性较强，与物质作用无选择性等特点。近10a来，国内外采γ射线辐照方法降解壳聚糖研究甚多[9-11]。研究表明，壳聚糖降解形成的低聚糖，比天然甲壳素和壳聚糖具有更多、更优良的生物学功能[12-14]。相对于化学法和酶解法，辐照法具有操作简便、可控性好，无须添加物的反应，节省能源，且生物相容性不受影响等特点（陈巍，2006）。壳聚糖辐射降解有2种途径：一是直接作用，即糖苷键的成键电子被γ射线激发，引起键断裂；二是间接作用，即辐射产生的电子、自由基等产物通过化学反应加速糖苷键的断裂[15]。甲壳素溶液中的辐照能量主要来源于水，能产生氢氧（·OH），水化电子（e-aq）和氢（·H）等自由基[16]，其中氢氧自由基主要参与降解壳聚糖分子链的反应[17]。李忠彦等研究表明，γ-射线辐射降解主要机理为：溶液中氢自由基，通过氢原子吸引，与壳聚糖分子反应，在碳原子处形成自由基，从而使糖苷键断裂发生重排，生成低聚壳聚糖[18]。
2 国内外研究现状及发展动态
国内外学者已经进行了大量的研究，前人的研究主要包括以下几个方面：
2.1 壳聚糖状态和辐照剂量方面 波兰的Relleve[19]等人采用脱乙酰度为88%的固态壳聚糖在0～120kGy的辐照剂量下进行试验，结果表明，随着辐照剂量的不断加大，壳聚糖的分子量也随之降低。但是高德玉等[20]研究结果表明，溶液态壳聚糖可比固态壳聚糖辐射降解效率提高50倍左右。张志亮等[21]研究结果表明，2%的壳聚糖溶液在浓度为2%的醋酸溶液中，在2kGy的辐照剂量下，壳聚糖的分子量明显降低。翟茂林等[22]，康斌等[23]探究了采用辐照前先将粉末状的壳聚糖用蒸馏水或一定浓度的双氧水浸润，然后再进行γ辐射降解，这样既可使壳聚糖分子膨胀并伸展，加快降解的速度，又能保证大部分的射线被壳聚糖吸收。康斌等[15]，龙德武等[23]，Choi et al[24]等人分别在固体状态和浸润状态下进行的研究结果，同样得出辐照剂量100kGy能有效降解壳聚糖的结论。
2.2 预处理气体与辐照机理方面 很多学者指出壳聚糖降解过程中参与的影响因素。被N2O气体预处理的壳聚糖溶液中的水化电子自由基能迅速转化氢氧自由基参加反应[17]。被O3气体预处理的壳聚糖溶液中的水化电子自由基能迅速转化氢氧自由基和氧气参加反应[25]。被O2气体预处理的壳聚糖溶液先是产生过氧化氢然后迅速转化成氢氧自由基和水化电子参加反应[26]（图1）。
图1 辐照降解过程中的影响因素
吴孝怀等研究了臭氧气体预处理后壳聚糖的降解反应和机理，结果表明，氧作为一种强氧化剂的引入，以进一步降低壳聚糖的分子量，有利于节省壳聚糖降解时的辐照成本。 2.3 辐射与降解产物关系方面 胡健等[27]分析辐照强度及辐照时间与降解产物平均分子量，还原糖分子量及分子量均一性之间关系，结果表明，降解产物平均分子量及还原糖分子量，随辐照强度及辐照时间增加而减小，且降解产物分子量均一程度随辐照剂量增加而提高。
3 结语
综上所述，辐照降解壳聚糖制备的寡聚糖分子量不一，需要进一步分离特定分子量，前人的研究主要集中在气体预处理，辐照与壳聚糖降解方面，重视产物分析多，对尤其是酶的协同作用对辐照降解中酶生化机制方面研究更少。气体预处理使得壳聚糖降解的速率更快、降解产物的分子量更小。一般单一的壳聚糖酶对壳聚糖的降解程度有限，而且增加酶量也难以提高水解程度。因此，今后应进一步研究和开发制备寡聚糖的简便方法。
参考文献
[1]Yao，Y.Y.，Shrestha，K.L.，Wu，Y.J.，et al.Structural simulation and protein engineering to convert an endo-chitosanase to and exo-chitosanase[J].Protein Eng.Des.Sel，2008，.21：561-566.
[2]Jung，W.J.，Kuk，J.H.，Kim，K.Y.，et al.Enzymatic characterization and classification of chitosanases[J].Kor.Soc.Appl.Biol.Chem，2005，48：16-22.
[3]Mitsutomi，M.，Isono，M.，Uchiyama，A.，et al.Chitosanase activity of the enzyme previously reported as β-1，3-1，4-glucanase from Bacillus circulans WL-12.Biosci.Biotech.Biochem，1988，62：2107-2114.
[4]Masato，I.Nagae，S.，Kawagishi，H.，Mitsuromi，M.et al.Action pattern of Bacillus sp.No 7-M chitosanase on partially N-acetylated chitosan[J].Biosci.Biotech.Biochem，1992，56：448-453.
[5]Yabuki，M，Uchiyama，A.，Suzuki，A.，et al.Purification and properties of chitosanase from Bacillus cirulans MH-K1[J].J.Gen.Appl.Microbiol，1998，34：255-270.
[6]Boucher，I.，Dupuy，A.，Vidal，P.，et al.Purification and characterization of a chitosanase from Streptomyces N174[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，1992，38：188-193.
[7]Saito，A.，Ooya，T.，Miyatsuchi，D.，et al.Molecular characterization and antifungal activity of a family 46 chitosanase from Amycolatopsis sp[J].CsO-2.FEMS.Microbiol.Lett，2009，293：79-84.
[8]陈小娥，夏文水，余晓斌.微生物壳聚糖酶研究进展[J].海洋科学，2004，28（3）：72-75.
[9]Zainol，I.，Md，H.，Mastor，A.Effect of γ-irradiation on the physical and mechanical properties of chitosan powder[J].Material Sci.Eng.C.，2009，29：292-297.
[10]Yoksan，R.，Chirachanchai，S.Silver nanoparticles dispersing in chitosan solution：preparation by γ-ray irradiation and their antimicrobial activities[J].Material Chem.Phys.，2009，115：296-302.
[11]Zhao，L.，H.Mitomo.Hydrogels of dihydroxypropyl chitosan crosslinked with irradiation at paste-like condition[J].Carbohydr.Polym，2009，76：314-319.
[12]Hirano M，Iwata.Uses and functions of chitin and chitosan oligosaccharide[J].New.Food.Indus，1998，40：17-22.
[13]Jung，Y.，J.，Shahidi，F.，Kim，S.K.Preparation of chitin and chitosan oligomers and their application in physiological functional foods[J].Food Rev.Int，2000，61：159-176.
[14]Jeon，Y.Y.，Shahidi，F.，Kim，S.K.Preparation of chitin and chitosan oligomers and their application in physiological functional foods[J].Food Rev.Int.，2000，61：159-176. [15]康斌，戚志强，伍亚军.γ辐射降解法制备小分子水溶性壳聚糖[J].辐射研究与辐射工艺学报，2006，24（2）：83-86.
[16]Wasikiewicz，J.M.，Yoshii，F.，Nagasawa，N.，et al. Degradation of chitosan and sodium alginate by gamma radiation，sonochemical and ultraviolet methods[J].Radiat.Phys.Chem.，2005，73：287-295.
[17]Ulanski，P.，Sonntag.，OH-Radical-induced chain scission of chitosan in the absence and presence of dioxygen[J].T.Roy.Soc.Chem，2000，2：2022-2028.
[18]李忠彦，陈搜，何小维，等.辐射在壳聚糖降解中应用[J].粮食与油脂，2007，6：44-46.
[19]Relleve，L.，Nagasawa，N，Luan，L.Q.et al.Degradation of carrageenan by radiation[J].Polym.Degrad.Stabil.，2005，87：403-410.
[20]高德玉，李红，李锦书，等.γ-射线辐照对壳聚糖相对分子质量影响[J].化学与黏合，2009，（31）1：28-30.
[21]张志亮，彭静，黄凌，等.壳聚糖在水溶液中的辐射降解反应[J].高分子学报，2006（6）：799-805.
[22]翟茂林，林琳，李久强.电离辐射技术在甲壳素/壳聚糖改性中的应用[J].高分子通报，2001（4）：45-50.
[23]龙德武，吴国忠，秦宗英.辐射法降解壳聚糖及其抑菌性能的研究[J].高分子材料科学与工程，2005，21（6）：240-242.
[24]Choi，W.S.，Ahn，K.J.，Lee，D.W.，et al.Preparatioin of chitosan oligomers by irradiation[J].Polym.Degrad.Stabil.，2002，78：533-538.
[25]Kubesch，K.，Zona，R，Solar，S.，et al.Degradation of catechol by ionizing radiation，ozone and the combined process ozone-electron-beam[J].Radiat.Phys.Chem.，2005，72：447-453.
[26]Furuta，M.，Ohashi，I.，Oka，M.et al.Irradiation effects on hydrases for biomedical applications[J].Radiat.Phys.Chem.，2000，57：455-457.
[27]胡健，赵国胶，姜涌明.γ-射线辐照降解壳聚搪的研究[J].扬州大学学报，1999，2（2）：51-54. （责编：张宏民）
关键词：伽马辐射；壳聚糖酶；壳聚糖
中图分类号 TQ929 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）22-37-02
1 壳聚糖降解酶及伽马辐射降解壳聚糖的研究
壳聚糖酶（chitosanase，EC 3.2.1.132），全名为壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶（chitosan-N-acetylglucosaminohydrolase），是一种对线性的壳聚糖具有水解专一性的酶。它是能分解壳聚糖的一种配糖类水解酶，根据酶的氨基酸序列的相似性，可将目前测得序列的壳聚糖酶分别归属糖苷水解酶5号、8号、46号、75号和80号（http：//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）[1]。根据底物专一性差别将壳聚糖酶进一步细分为4类，即壳聚糖酶Ⅰ、壳聚糖酶Ⅱ、壳聚糖酶Ⅲ和壳聚糖酶IV[2-3]，第一类酶可以水解 GlcN-GlcN键及GlcNAc-GlcN键；第二类酶只能水解GlcN-GlcN键；第三类酶既可水解GlcN-GlcN键，又可水解GlcN–ClcNAc；第四类酶可以水解GlcN-GlcN键，GlcN-GlcNAc键及GlcNAc-GlcN键（表1）。
表1 微生物分泌的壳聚糖酶的家族和亚属
[ Family 8 ＼& Family 46&80 ＼&Subclass II＼&Subclass III＼&Subclass I＼&Subclass IV＼&
No 7-M[4]＼&B.Circulans
WL-12[3]＼&B.Circulans
MH-K1[5]＼&Streptomyces
sp.N174[6]＼&Amycolatopsis.
sp.Cso-2[7]＼&]
注：-○-；葡萄糖胺残基（N-acetyl-β-D-glucosamine residue）；-●-；葡萄糖残基（D-glucosamine residue）。
壳聚糖酶被更广泛的分为外切酶和内切酶2种类型。内切型壳聚糖酶的作用以任意释放二聚体、三聚体、四聚体等低聚糖混合物为主，外切型的作用则从壳聚糖的非还原末端开始降解生成单糖/二糖残基—氨基葡萄糖[8]。
γ射线是一种电磁波，它具有能量较高，穿透性较强，与物质作用无选择性等特点。近10a来，国内外采γ射线辐照方法降解壳聚糖研究甚多[9-11]。研究表明，壳聚糖降解形成的低聚糖，比天然甲壳素和壳聚糖具有更多、更优良的生物学功能[12-14]。相对于化学法和酶解法，辐照法具有操作简便、可控性好，无须添加物的反应，节省能源，且生物相容性不受影响等特点（陈巍，2006）。壳聚糖辐射降解有2种途径：一是直接作用，即糖苷键的成键电子被γ射线激发，引起键断裂；二是间接作用，即辐射产生的电子、自由基等产物通过化学反应加速糖苷键的断裂[15]。甲壳素溶液中的辐照能量主要来源于水，能产生氢氧（·OH），水化电子（e-aq）和氢（·H）等自由基[16]，其中氢氧自由基主要参与降解壳聚糖分子链的反应[17]。李忠彦等研究表明，γ-射线辐射降解主要机理为：溶液中氢自由基，通过氢原子吸引，与壳聚糖分子反应，在碳原子处形成自由基，从而使糖苷键断裂发生重排，生成低聚壳聚糖[18]。
2 国内外研究现状及发展动态
国内外学者已经进行了大量的研究，前人的研究主要包括以下几个方面：
2.1 壳聚糖状态和辐照剂量方面 波兰的Relleve[19]等人采用脱乙酰度为88%的固态壳聚糖在0～120kGy的辐照剂量下进行试验，结果表明，随着辐照剂量的不断加大，壳聚糖的分子量也随之降低。但是高德玉等[20]研究结果表明，溶液态壳聚糖可比固态壳聚糖辐射降解效率提高50倍左右。张志亮等[21]研究结果表明，2%的壳聚糖溶液在浓度为2%的醋酸溶液中，在2kGy的辐照剂量下，壳聚糖的分子量明显降低。翟茂林等[22]，康斌等[23]探究了采用辐照前先将粉末状的壳聚糖用蒸馏水或一定浓度的双氧水浸润，然后再进行γ辐射降解，这样既可使壳聚糖分子膨胀并伸展，加快降解的速度，又能保证大部分的射线被壳聚糖吸收。康斌等[15]，龙德武等[23]，Choi et al[24]等人分别在固体状态和浸润状态下进行的研究结果，同样得出辐照剂量100kGy能有效降解壳聚糖的结论。
2.2 预处理气体与辐照机理方面 很多学者指出壳聚糖降解过程中参与的影响因素。被N2O气体预处理的壳聚糖溶液中的水化电子自由基能迅速转化氢氧自由基参加反应[17]。被O3气体预处理的壳聚糖溶液中的水化电子自由基能迅速转化氢氧自由基和氧气参加反应[25]。被O2气体预处理的壳聚糖溶液先是产生过氧化氢然后迅速转化成氢氧自由基和水化电子参加反应[26]（图1）。
图1 辐照降解过程中的影响因素
吴孝怀等研究了臭氧气体预处理后壳聚糖的降解反应和机理，结果表明，氧作为一种强氧化剂的引入，以进一步降低壳聚糖的分子量，有利于节省壳聚糖降解时的辐照成本。 2.3 辐射与降解产物关系方面 胡健等[27]分析辐照强度及辐照时间与降解产物平均分子量，还原糖分子量及分子量均一性之间关系，结果表明，降解产物平均分子量及还原糖分子量，随辐照强度及辐照时间增加而减小，且降解产物分子量均一程度随辐照剂量增加而提高。
3 结语
综上所述，辐照降解壳聚糖制备的寡聚糖分子量不一，需要进一步分离特定分子量，前人的研究主要集中在气体预处理，辐照与壳聚糖降解方面，重视产物分析多，对尤其是酶的协同作用对辐照降解中酶生化机制方面研究更少。气体预处理使得壳聚糖降解的速率更快、降解产物的分子量更小。一般单一的壳聚糖酶对壳聚糖的降解程度有限，而且增加酶量也难以提高水解程度。因此，今后应进一步研究和开发制备寡聚糖的简便方法。
参考文献
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[3]Mitsutomi，M.，Isono，M.，Uchiyama，A.，et al.Chitosanase activity of the enzyme previously reported as β-1，3-1，4-glucanase from Bacillus circulans WL-12.Biosci.Biotech.Biochem，1988，62：2107-2114.
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[5]Yabuki，M，Uchiyama，A.，Suzuki，A.，et al.Purification and properties of chitosanase from Bacillus cirulans MH-K1[J].J.Gen.Appl.Microbiol，1998，34：255-270.
[6]Boucher，I.，Dupuy，A.，Vidal，P.，et al.Purification and characterization of a chitosanase from Streptomyces N174[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，1992，38：188-193.
[7]Saito，A.，Ooya，T.，Miyatsuchi，D.，et al.Molecular characterization and antifungal activity of a family 46 chitosanase from Amycolatopsis sp[J].CsO-2.FEMS.Microbiol.Lett，2009，293：79-84.
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[17]Ulanski，P.，Sonntag.，OH-Radical-induced chain scission of chitosan in the absence and presence of dioxygen[J].T.Roy.Soc.Chem，2000，2：2022-2028.
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[19]Relleve，L.，Nagasawa，N，Luan，L.Q.et al.Degradation of carrageenan by radiation[J].Polym.Degrad.Stabil.，2005，87：403-410.
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