【摘 要】
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【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法，将其命名为PSORA:Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR（TAIL-PCR）的扩增产物进行高通量测序，随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点，该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增
【基金项目】
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国家自然科学基金（31460466）；
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【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法，将其命名为PSORA:Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR（TAIL-PCR）的扩增产物进行高通量测序，随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点，该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增的要求。PSORA中使用的引物一侧为简并引物，另一侧为T-DNA特异性引物。在特异性引物的5’端设计6 nt的样品标签（Barcode），用于标记不同的转化事件。所使用的5个转基因烟草株系（L1、L6、L9、L15和L19）由农杆菌介导质粒pBI121转化获得。此外，通过标准PCR对PSORA的结果进行验证。【结果】利用PSORA对5个转基因株系的T-DNA插入位点进行分析，结果显示，L6含2个插入位点（NW＿015801367的36 316 bp处和NW＿015950898的42 202 bp处），L9、L15和L19各含1个插入位点（L9的插入位点为NW＿015943682的235 969 bp处；L15的插入位点为NW＿015802951的60 529 bp处；L19的插入位点为NW＿015863435的12 188 bp处），L1的插入位点未能成功获取。对生物信息学分析结果进行PCR验证，含不同插入位点的转基因株系之间可互为阴性对照，野生型（WT）作为空白对照，结果表明，在各转基因株系中均得到与预期一致的特异性扩增，该结果验证了PSORA的有效性。【结论】PSORA是一种分析T-DNA插入位点的有效方法，可以同时分析多个插入事件，相对于传统的染色体步移方法更简便、快速。
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