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摘要 植物青枯病生防菌株PBWl对植物青枯病的防效可高达70％以上。本文首先获得了PBW1500 ml摇瓶培养的最佳条件：30℃、初始pH7、接种量为1％、装液量为120 mL、摇床转速为220 r/min；在最佳条件下培养48 h的菌体浓度达4.2×1012 cfu/mL；同时还对500 mL摇瓶培养过程中菌体生长、还原糖、总糖及pH变化特征进行了研究。此外，本文还在6L全自动发酵罐上对PBWl培养过程中的菌体生长、还原糖、氨基氮、pH和DO的变化特征进行了研究，培养48h的菌体浓度达4.76×1012cfu/mL。
关键词 植物青枯病；生物防治；PBW1菌株；培养工艺
中图分类号 S476.1
植物青枯病是由茄青枯劳尔氏菌(Ralstonia so-lanacearum)引起的一种世界性土传植物病害，主要发生在热带和亚热带地区，发生普遍、危害严重，此病于1864年首次发现至今已有140多年历史。青枯病寄主范围很广，可侵染44科近300种植物，其中烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃薯和生姜等被害较严重、分布较广。在我国，植物青枯病主要发生在长江以南地区(福建、广东、广西、四川、湖南、安徽、江苏、浙江和江西等)，近年的调查发现，此病有向长江以北地区(山东等地)发展的趋势。植物青枯病发病率一般为20％～30％，严重的地区可高达100％，甚至毁产绝收。对于植物青枯病的防治研究，国内外一直是以综合防治为指导思想。综合防治的重点又是放在抗病育种上，但迄今为止，具有抗青枯病性能的作物品种很少，且抗性极易丢失；嫁接方法防治番茄青枯病虽获得成功，但技术难度大，难以推广和普及；水旱轮作在一定程度上能够较好地防治青枯病，但受地域条件的限制，难以被普遍应用；化学农药防治虽有一定的防效，但难以达到最低的防治要求，且病原菌很快会对化学农药产生抗性。由此可见，迄今为止，国内外尚无防治植物青枯病的有效方法。近年来笔者所在实验室在利用微生物活菌制剂防治植物青枯病方面开展了大量的研究工作，利用独特的菌种筛选模型筛选出防治番茄、辣椒、茄子、烟草等作物青枯病的高效生防菌株PBW1，为了更好地开发利用生防菌株PBW1防治植物青枯病，降低其培养成本，本文报道了植物青枯病高效生防菌株PBW1的摇瓶培养研究结果和在最佳条件下PBW1摇瓶培养过程中菌体生长、pH、还原糖及总糖变化特征；此外，本文还报道了生防菌株PBW1在6L全自动发酵罐培养过程中菌体生长、总糖及氨基氮的变化特征。本文研究结果为PBW1的大规模培养工艺确定及其培养过程放大奠定了较好的基础。
1．3 试验方法
1．3．1 种子培养
将菌株移入斜面培养基，置于30℃培养箱中培养2～3 d；将斜面菌体挖块接入摇瓶(500 mL搖瓶装入120 mL培养基)，在30℃、220 r.min条件下摇床培养48 h。
1．3．2 摇瓶培养
向装有120 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中接人1.2 mL种子液，在30℃、220 r.min的摇床上培养48 h或72 h。考察温度、培养基装量、摇床转速、接种量和初始pH等5个因素对最终培养液中菌体浓度的影响，确定最佳培养条件。
1．3．3 发酵罐培养
将培养48 h的种子液，按1％的接种量(40 mL种子液)接入装有6L培养基的发酵罐中，温度控制为30℃，气液比为1:1，泡敌加入量为0.05％，调节搅拌转速使溶氧不低于15％。培养过程的pH、温度及溶氧自动记录，间歇取样测定培养液中的菌体浓度、还原糖及氨基氮。
1．3．4 分析方法
培养液中菌体浓度采用稀释平板计数法测定；还原糖、总糖及氨基氮则分别采用费林试剂法和甲醛法。
2 结果与讨论
2．1 摇瓶培养
考察温度、初始pH、摇床转速、装量、接种量等5个因素对PBW1菌株生长的影响，确定其最佳培养条件。
2．1．1 培养温度
选定温度为25、30、35℃和41℃进行试验，由图1可见温度在30℃时，培养液中的最终菌体浓度为最大，高达4.5×1012。cfu.mL，在25℃和35℃下的菌体浓度分别为2.28×1012cfu.mL和7.8×1011cfu.mL，而在41℃时的菌体浓度仅为1.01×1011cfu.mL，菌体基本不生长。据此，可以认为PBW1的生长温度范围为25～35℃，其最适生长温度为30℃。
2．1．2 初始pH
在初始pH为5～10范围内进行试验，其结果见图2，由该图看出，PBWl在初始pH5～10范围内均能生长，最适生长的初始pH为7，这时菌体浓度为4.4×1012cfu.mL，这表明该菌适宜在pH中性范围生长。
2．1．3 转速
由图3可见，PBWl在转速分别为130、170、220 r.min和250 r.min条件下培养48 h，培养液中的菌体浓度依次为4.1×1011、1.35×1012、2.83×1012、4.5×1012cfu.mL。转速越高，供氧量越大，试验结果可说明在一定条件下溶氧浓度越高，越有利于PBW1的生长。
2．1．4 装液量
在500 mL摇瓶中分别装入70、120、170 mL和220 mL培养基(接种量仍为1％)，培养48 h后的菌体浓度依次为4.7×1012、4.4×1012、2.32×1012cfu.mL和9.9×1011cfu.mL(图4)，结果表明装液量越少，PBW1生长越快。由于装液量太少，不利于取样分 析，且装液量为70 mL时菌体生长和装液量为120 mL时相近，故装液量选为120 mL。在相同条件下，装液量越少，相对供氧量越大，PBW1生长越快，这和转速试验结果一致。
2．1．5 接种量
在其他条件相同情况下，接种量分别为0.5％、1％和1.5％时，培养72 h后相应的培养液中的菌体浓度分别为2.82×1012、4.2×1012、4.6×1012cfu.mL，结果表明培养PBWl时，在一定范围内，接种量越大，菌体生长越快，但接种量为1％和1.5％时培养72 h的培养液中的菌体浓度差别不大(图5)，因而一般选定接种量为1％。
2．1．6 摇瓶培养的最佳工艺条件
由上述试验结果可知，在本文试验条件下，PBWl最佳的500 mL摇瓶培养工艺为：30℃、初始pH7、接种量为1％、装液量为120 mL、摇床转速为220 r.min。在一定范围内，接种量越大，菌体生长越快；摇床转速越大、装液量越少，菌体生长越快，这说明在一定范围内，培养液中溶氧越大，越有利于PBW1的生长。
2．2 PBW1摇瓶培养过程中菌体浓度、pH、还原糖
及总糖变化特征
在最佳工艺条件下进行PBW1的培养，测定其培养过程的菌体浓度、pH、还原糖及总糖变化曲线，所得结果示于图6。由该图可见，培养前期菌体生长较快，而培养至约24 h时，菌体生长速度很缓慢，培养至约100 h后，菌体浓度开始下降，这可能是菌体自溶所致。培养开始后pH下降，至约24h，pH降至最低，随后开始上升，至约48 h时pH上升速度开始变得很缓慢。在培养前期还原糖和总糖消耗速度较慢，但在20～36 h内糖消耗较快，以至于还原糖浓度接近于0，随后糖浓度基本不变。菌体浓度的变化与pH、还原糖及总糖的变化有一定的相关性，当培养进行至约36 h时，培养液中还原糖和总糖浓度降至很低，pH升到8.51，菌体生长已基本进入平衡期，菌体浓度略有增加，考虑到菌体浓度在48 h以后增加不大，因此，选择48 h为摇瓶培养终点，此时菌体浓度为4.2×1012 cfu.mL。
2．3 菌株的发酵罐培养过程特征
图7所示的为PBW1在全自动发酵罐中的培养过程曲线。由该图可见，在0～4 h内菌体生长处于延滞期，4～12 h期间菌体生长很快，在随后的6 h内菌体生长缓慢，并达到最大菌体浓度；18 h以后，菌体浓度出现下降趋势，结合氨基氮的变化曲线初步判断，这可能是有部分菌体自溶所致。在0～4 h内还原糖浓度和氨基氮浓度下降很缓慢，在4～12 h内，还原糖浓度、氨基氮浓度降低较快，同时菌体生长速度较快，在随后的6 h内还原糖和氨基氮浓度下降缓慢，18 h以后，还原糖浓度变化非常缓慢，而氨基氮浓度开始上升，这表明菌体停止生长，可能出现自溶现象。在4 h以前，pH变化缓慢，在4～12 h，pH下降速度较快，说明菌体利用糖产生有机酸，使pH降低较快，12 h以后，pH开始缓慢回升，说明培养液中糖浓度很低，菌体生长开始利用有机酸，使pH出现回升。在2 h前，溶氧浓度降低较为缓慢，但2～4 h内溶氧下降很快，至4 h时降到最低点，这时菌体生长速度较快，为了维持溶氧不低于15％，转速由600 r.min调至700 r.min，此时，菌体生长很快，耗氧量大，溶氧下降快，约6 h时将转速由700 r.min增至800 r.min，在9～12 h内，溶氧下降缓慢，随后的2 h内溶氧开始上升，菌体生长缓慢，在约14 h时，将转速降为700 r.min，说明菌体可能开始死亡或自溶，到30 h，菌体浓度降至很低，溶氧开始回升。由此可见溶氧变化曲线可反映菌体的生长状况。
3 结论
(1)以青枯病高效生防菌株PBW1的培养为研究对象，以最终的菌体浓度的高低为指标，研究了PBWl在500 mL摇瓶中的最佳培养条件。结果表明：在本文试验范围内，PBWl摇瓶培养的最佳工艺为：30℃、初始pH7、接种量为1％、500 mL摇瓶装液量为120 mL、摇床转速为220 r.min。在一定范围内，接种量越大，菌体生长越快；摇床转速越大、装液量越少，菌体生长越快，这说明在一定范围内，培养液中溶氧越大，越有利于PBW1的生长。
(2)在最佳培养条件下进行了摇瓶培养试验，结果表明，培养48 h时的菌体浓度达4.2×1012cfu.mL；同时获得了PBW1菌株的摇瓶培养过程中的菌體生长、pH、还原糖及总糖变化特征。
(3)利用摇瓶培养结果，在6L全自动发酵罐上进行了PBWl的培养研究，结果表明，培养18 h的菌体浓度达最大，其值为4.76×1012cfu.mL；同时对PBW1在发酵罐培养过程中的菌体生长、pH、还原糖、氨基氮及溶氧的变化特征进行了研究，这为PBWl的大规模培养提供了一定的依据。
关键词 植物青枯病；生物防治；PBW1菌株；培养工艺
中图分类号 S476.1
植物青枯病是由茄青枯劳尔氏菌(Ralstonia so-lanacearum)引起的一种世界性土传植物病害，主要发生在热带和亚热带地区，发生普遍、危害严重，此病于1864年首次发现至今已有140多年历史。青枯病寄主范围很广，可侵染44科近300种植物，其中烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃薯和生姜等被害较严重、分布较广。在我国，植物青枯病主要发生在长江以南地区(福建、广东、广西、四川、湖南、安徽、江苏、浙江和江西等)，近年的调查发现，此病有向长江以北地区(山东等地)发展的趋势。植物青枯病发病率一般为20％～30％，严重的地区可高达100％，甚至毁产绝收。对于植物青枯病的防治研究，国内外一直是以综合防治为指导思想。综合防治的重点又是放在抗病育种上，但迄今为止，具有抗青枯病性能的作物品种很少，且抗性极易丢失；嫁接方法防治番茄青枯病虽获得成功，但技术难度大，难以推广和普及；水旱轮作在一定程度上能够较好地防治青枯病，但受地域条件的限制，难以被普遍应用；化学农药防治虽有一定的防效，但难以达到最低的防治要求，且病原菌很快会对化学农药产生抗性。由此可见，迄今为止，国内外尚无防治植物青枯病的有效方法。近年来笔者所在实验室在利用微生物活菌制剂防治植物青枯病方面开展了大量的研究工作，利用独特的菌种筛选模型筛选出防治番茄、辣椒、茄子、烟草等作物青枯病的高效生防菌株PBW1，为了更好地开发利用生防菌株PBW1防治植物青枯病，降低其培养成本，本文报道了植物青枯病高效生防菌株PBW1的摇瓶培养研究结果和在最佳条件下PBW1摇瓶培养过程中菌体生长、pH、还原糖及总糖变化特征；此外，本文还报道了生防菌株PBW1在6L全自动发酵罐培养过程中菌体生长、总糖及氨基氮的变化特征。本文研究结果为PBW1的大规模培养工艺确定及其培养过程放大奠定了较好的基础。
1．3 试验方法
1．3．1 种子培养
将菌株移入斜面培养基，置于30℃培养箱中培养2～3 d；将斜面菌体挖块接入摇瓶(500 mL搖瓶装入120 mL培养基)，在30℃、220 r.min条件下摇床培养48 h。
1．3．2 摇瓶培养
向装有120 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中接人1.2 mL种子液，在30℃、220 r.min的摇床上培养48 h或72 h。考察温度、培养基装量、摇床转速、接种量和初始pH等5个因素对最终培养液中菌体浓度的影响，确定最佳培养条件。
1．3．3 发酵罐培养
将培养48 h的种子液，按1％的接种量(40 mL种子液)接入装有6L培养基的发酵罐中，温度控制为30℃，气液比为1:1，泡敌加入量为0.05％，调节搅拌转速使溶氧不低于15％。培养过程的pH、温度及溶氧自动记录，间歇取样测定培养液中的菌体浓度、还原糖及氨基氮。
1．3．4 分析方法
培养液中菌体浓度采用稀释平板计数法测定；还原糖、总糖及氨基氮则分别采用费林试剂法和甲醛法。
2 结果与讨论
2．1 摇瓶培养
考察温度、初始pH、摇床转速、装量、接种量等5个因素对PBW1菌株生长的影响，确定其最佳培养条件。
2．1．1 培养温度
选定温度为25、30、35℃和41℃进行试验，由图1可见温度在30℃时，培养液中的最终菌体浓度为最大，高达4.5×1012。cfu.mL，在25℃和35℃下的菌体浓度分别为2.28×1012cfu.mL和7.8×1011cfu.mL，而在41℃时的菌体浓度仅为1.01×1011cfu.mL，菌体基本不生长。据此，可以认为PBW1的生长温度范围为25～35℃，其最适生长温度为30℃。
2．1．2 初始pH
在初始pH为5～10范围内进行试验，其结果见图2，由该图看出，PBWl在初始pH5～10范围内均能生长，最适生长的初始pH为7，这时菌体浓度为4.4×1012cfu.mL，这表明该菌适宜在pH中性范围生长。
2．1．3 转速
由图3可见，PBWl在转速分别为130、170、220 r.min和250 r.min条件下培养48 h，培养液中的菌体浓度依次为4.1×1011、1.35×1012、2.83×1012、4.5×1012cfu.mL。转速越高，供氧量越大，试验结果可说明在一定条件下溶氧浓度越高，越有利于PBW1的生长。
2．1．4 装液量
在500 mL摇瓶中分别装入70、120、170 mL和220 mL培养基(接种量仍为1％)，培养48 h后的菌体浓度依次为4.7×1012、4.4×1012、2.32×1012cfu.mL和9.9×1011cfu.mL(图4)，结果表明装液量越少，PBW1生长越快。由于装液量太少，不利于取样分 析，且装液量为70 mL时菌体生长和装液量为120 mL时相近，故装液量选为120 mL。在相同条件下，装液量越少，相对供氧量越大，PBW1生长越快，这和转速试验结果一致。
2．1．5 接种量
在其他条件相同情况下，接种量分别为0.5％、1％和1.5％时，培养72 h后相应的培养液中的菌体浓度分别为2.82×1012、4.2×1012、4.6×1012cfu.mL，结果表明培养PBWl时，在一定范围内，接种量越大，菌体生长越快，但接种量为1％和1.5％时培养72 h的培养液中的菌体浓度差别不大(图5)，因而一般选定接种量为1％。
2．1．6 摇瓶培养的最佳工艺条件
由上述试验结果可知，在本文试验条件下，PBWl最佳的500 mL摇瓶培养工艺为：30℃、初始pH7、接种量为1％、装液量为120 mL、摇床转速为220 r.min。在一定范围内，接种量越大，菌体生长越快；摇床转速越大、装液量越少，菌体生长越快，这说明在一定范围内，培养液中溶氧越大，越有利于PBW1的生长。
2．2 PBW1摇瓶培养过程中菌体浓度、pH、还原糖
及总糖变化特征
在最佳工艺条件下进行PBW1的培养，测定其培养过程的菌体浓度、pH、还原糖及总糖变化曲线，所得结果示于图6。由该图可见，培养前期菌体生长较快，而培养至约24 h时，菌体生长速度很缓慢，培养至约100 h后，菌体浓度开始下降，这可能是菌体自溶所致。培养开始后pH下降，至约24h，pH降至最低，随后开始上升，至约48 h时pH上升速度开始变得很缓慢。在培养前期还原糖和总糖消耗速度较慢，但在20～36 h内糖消耗较快，以至于还原糖浓度接近于0，随后糖浓度基本不变。菌体浓度的变化与pH、还原糖及总糖的变化有一定的相关性，当培养进行至约36 h时，培养液中还原糖和总糖浓度降至很低，pH升到8.51，菌体生长已基本进入平衡期，菌体浓度略有增加，考虑到菌体浓度在48 h以后增加不大，因此，选择48 h为摇瓶培养终点，此时菌体浓度为4.2×1012 cfu.mL。
2．3 菌株的发酵罐培养过程特征
图7所示的为PBW1在全自动发酵罐中的培养过程曲线。由该图可见，在0～4 h内菌体生长处于延滞期，4～12 h期间菌体生长很快，在随后的6 h内菌体生长缓慢，并达到最大菌体浓度；18 h以后，菌体浓度出现下降趋势，结合氨基氮的变化曲线初步判断，这可能是有部分菌体自溶所致。在0～4 h内还原糖浓度和氨基氮浓度下降很缓慢，在4～12 h内，还原糖浓度、氨基氮浓度降低较快，同时菌体生长速度较快，在随后的6 h内还原糖和氨基氮浓度下降缓慢，18 h以后，还原糖浓度变化非常缓慢，而氨基氮浓度开始上升，这表明菌体停止生长，可能出现自溶现象。在4 h以前，pH变化缓慢，在4～12 h，pH下降速度较快，说明菌体利用糖产生有机酸，使pH降低较快，12 h以后，pH开始缓慢回升，说明培养液中糖浓度很低，菌体生长开始利用有机酸，使pH出现回升。在2 h前，溶氧浓度降低较为缓慢，但2～4 h内溶氧下降很快，至4 h时降到最低点，这时菌体生长速度较快，为了维持溶氧不低于15％，转速由600 r.min调至700 r.min，此时，菌体生长很快，耗氧量大，溶氧下降快，约6 h时将转速由700 r.min增至800 r.min，在9～12 h内，溶氧下降缓慢，随后的2 h内溶氧开始上升，菌体生长缓慢，在约14 h时，将转速降为700 r.min，说明菌体可能开始死亡或自溶，到30 h，菌体浓度降至很低，溶氧开始回升。由此可见溶氧变化曲线可反映菌体的生长状况。
3 结论
(1)以青枯病高效生防菌株PBW1的培养为研究对象，以最终的菌体浓度的高低为指标，研究了PBWl在500 mL摇瓶中的最佳培养条件。结果表明：在本文试验范围内，PBWl摇瓶培养的最佳工艺为：30℃、初始pH7、接种量为1％、500 mL摇瓶装液量为120 mL、摇床转速为220 r.min。在一定范围内，接种量越大，菌体生长越快；摇床转速越大、装液量越少，菌体生长越快，这说明在一定范围内，培养液中溶氧越大，越有利于PBW1的生长。
(2)在最佳培养条件下进行了摇瓶培养试验，结果表明，培养48 h时的菌体浓度达4.2×1012cfu.mL；同时获得了PBW1菌株的摇瓶培养过程中的菌體生长、pH、还原糖及总糖变化特征。
(3)利用摇瓶培养结果，在6L全自动发酵罐上进行了PBWl的培养研究，结果表明，培养18 h的菌体浓度达最大，其值为4.76×1012cfu.mL；同时对PBW1在发酵罐培养过程中的菌体生长、pH、还原糖、氨基氮及溶氧的变化特征进行了研究，这为PBWl的大规模培养提供了一定的依据。