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摘要 [目的]利用高效液相色谱测定梵净山4种紫苏（FMPF）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛含量。[方法]在单因素试验结果的基础上，以甲醇为提取剂，紫苏醛提取率为响应值，对料液比、提取时间进行响应面法优化。其他固定条件为超声提取温度35 ℃，提取1次，频率40 kHz， 功率300 W。以最佳条件提取、高效液相色谱测定4种紫苏4个部位中紫苏醛。[结果]最优条件：料液比1∶60、提取时间24 min；同一紫苏茎、叶、果萼、籽中紫苏醛含量均有显著差异（P<0.05），叶>果萼>茎>籽；4种紫苏叶、果萼紫苏醛含量差异显著（P<0.05）；FMPF1（叶阔卵形、两面紫色、边缘锯齿浅）和FMPF4（叶卵形、两面紫色、具狭而深锯齿）紫苏叶中紫苏醛含量分别为7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分别为3.712和3.887 mg/g。[结论]梵净山紫苏（FMPF1、FMPF4）是提取紫苏醛的优质资源，同时提示紫苏醛含量与叶型具有一定的相关性。
关键词 梵净山；紫苏；紫苏醛；不同部位；响应面法
中图分类号 R282 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）08-0174-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.046
Abstract [Objective] The content of perillaldehyde in stems，leaves，fruit calyx and seeds of four kinds of Perilla frutescens from Fanjin Mountain （FMPF） was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.[Method]Based on the single factor test results，taking methyl alcohol as the extraction solvent，solidliquid ratio and extraction time were considered for the further optimized using response surface method （RSM） when perillaldehyde content（PAC）was used as response.And other ultrasonic conditions were fixed for extraction temperature 35 ℃，times of 1，frequency 40 kHz，power 300 W.Perillaldehyde from four parts of P.frutescens were extracted under optimal conditions and determined by HPLC.[Result] The optimum conditions were obtained as follows：solidliquid ratio 1∶60，extraction time 24 min.PAC in stems，leaves，fruit calyx and seeds of the same P.frutescens were significantly differences （P<0.05），leaves>fruit calyx>stems>seeds.PAC in leaves or fruit calyx between 4 kinds of P.frutescens also had significant differences （P<0.05），and PAC in leaves of FMPF1（broad ovate，purplish on both sides leaves and its margin is shallow sawtooth）or FMPF4（ovate，purplish on both sides leaves and its margin is deep sawtooth）were 7.537 and 6.139 mg/g，respectively，and PAC of their fruit calyx is 3.712 and 3.887 mg/g，respectively.[Conclusion] The P.frutescens （FMPF1，FMPF4） from Fanjing Mountain is a good resource for extracting perillaldehyde.Simultaneously，it is suggested that there is a correlation between leaf morphology and PAC.
Key words Fanjing Mountain；Perilla frutescens；Perillaldehyde；Different parts；Response surface method
紫蘇 （Perilla frutescens）属于唇形科紫苏属一年生草本植物，有1种3变种，分别为紫苏原变种、野生紫苏、耳齿紫苏、回回苏，其叶、茎、籽均可入药[1-2]。紫苏醛是一种单萜类化合物，是紫苏叶挥发油的主要成分和特征香气成分，广泛地应用于食用香料配方和日用香精配方[3]。《中国药典》规定：紫苏叶应使用紫苏醛型药材，藿香正气口服液的紫苏叶挥发油中紫苏醛的含量不低于25%；日本药局方规定紫苏叶中紫苏醛的含量不得少于0.08%。现代药理试验表明，紫苏醛具有抗衰老、降血脂、抗炎症、抗抑郁、增强免疫、抑菌抗肿瘤等功能[4-11]。可见，紫苏醛是紫苏叶挥发油中主要的一种活性物质。 梵净山是武陵山脉的主峰，蕴含着丰富的紫苏资源[12]，然而针对贵州梵净山紫苏（FMPF）紫苏醛含量的研究鲜见报道。笔者利用高效液相色谱测定梵净山4种紫苏茎、叶、果萼和籽4个部位紫苏醛的含量，并揭示紫苏醛的含量与紫苏叶型的相关性，为梵净山紫苏资源的利用与开发提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。梵净山紫苏（FMPF）由铜仁职业技术学院梁玉勇教授鉴定。FMPF1：叶阔卵形，先端短尖，基部圆形或阔锲形，上面紫绿，背面紫色，边缘锯齿；FMPF2：叶阔卵形，基部圆形或阔锲形，两面绿色，边缘锯齿； FMPF3：叶卵形，先端长而尖，基部圆形或阔锲形，上面绿，背面紫绿色，边缘具粗锯齿； FMPF4：叶卵形，先端长而尖，基部圆形或阔锲形，上面紫绿，背面紫色，具狭而深锯齿。样品图如图1所示。 2017年11月在梵净山收集种子，2018年3月播种于铜仁市漾头镇，12月15日收获，自然晾干茎、叶、果萼、种子。
1.1.2 仪器。Agilent1100高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）；色谱柱 Agilent 5 TC C18（2） 150 mm×4.6 mm；电子精密分析天平CPA225D（赛多利斯斯泰迪有限公司）； 粉碎机RRHP-100（上海菲力博实业有限公司）；旋转蒸发器RE-52AA （上海亚荣生化仪器厂）；超声波清洗机SB52000 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；超纯水仪New Human Power Ⅰ （Human Corporation）。
1.1.3 试剂。紫苏醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111806-201806，纯度≥ 95.7% ）、甲醇（色谱纯，Tedia Company，Inc.）、超纯水（自制）。
1.2 方法
1.2.1 紫苏醛的测定方法。
1.2.1.1 样品溶液的制备。将紫苏叶（FMPF1）药材粉碎，粉末过40目，精密称定1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40 mL，于35 ℃水浴中超声提取 10 min（频率40 kHz， 功率300 W），提取液过滤，滤液旋干，甲醇定容至10 mL。
1.2.1.2 色谱条件。色谱柱为Agilent 5 TC C18（2） 150 mm×4.6 mm，流动相为甲醇∶水（78∶22），流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。
1.2.1.3 标准曲线的绘制。精密移取200 μL紫苏醛对照品，用甲醇定容至10 mL，得到20 μL/mL紫苏醛对照品储备液（紫苏醛密度为0.96 g/mL）。精密吸取3、6、12、24、48、96、192 μL紫苏醛对照品储备液，分别置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。按“1.2.1.2”色谱条件测定紫苏醛的含量，以对照品紫苏醛的质量浓度X（μg/mL）和峰面积Y绘制回归曲线。
1.2.1.4 精密度。同一对照品溶液，连续进样6次，记录紫苏醛峰面积。
1.2.1.5 稳定性。同一紫苏样品溶液，在2、4、8、16、24、48 h记录紫苏醛峰面积。
1.2.1.6 回收率。向5个1.0 mL已知浓度的样品溶液分别加入3、6、12、24、48 μL对照品储备液，测定加样回收率。
1.2.2 单因素试验。
1.2.2.1 提取温度对紫苏醛提取率的影响。称取4份0.5 g紫苏叶，以料液比1∶60（m∶V） 加入甲醇溶液，分别在25、35、45和55 ℃的条件下，以频率40 kHz、功率300 W超声提取10 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.2.2 料液比对紫苏醛提取率的影响。称取4份0.5 g紫苏叶，分别以料液比1∶40、1∶60、1∶80、1∶100加入甲醇溶液，以温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W超声提取10 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.2.3 提取时间对紫苏醛提取率的影响。
称取4份0.5 g紫苏叶，以料液比1∶60加入甲醇溶液，以温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W超声分别提取5、10、15、20 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.2.4 提取次数对紫苏醛提取率的影响。
称取一份0.5 g紫苏叶，以料液比1∶60加入甲醇溶液，以温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W超声提取3次，每次10 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.3 響应面优化设计。
在单因素试验结果的基础上，选出对紫苏醛提取效果影响较大的2个因素进行响应面优化。其他条件固定为提取次数1次、温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W。采用两因素三水平的中心组合设计（central composite design，CCD），如表1所示。以紫苏醛提取率为响应值，利用Design-Expent 8.0软件进行数据分析，得出紫苏醛的最优提取条件，并对其进行验证。
1.2.4 4种紫苏及其不同部位紫苏醛含量的比较。
采用响应面优化分析得到的以紫苏醛提取率为响应值的最佳提取条件，对4种紫苏（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛进行提取，并采用“1.2.1.2”HPLC色谱分析方法对紫苏醛进行含量测定。
1.2.5 不同生长时期紫苏叶中紫苏醛含量的变化。
以最佳的提取条件对4种紫苏3个不同生长时期的叶中紫苏醛含量进行测定。营养生长期，茎叶生长旺盛，简称营养期，于8月17日采集；开花期，于10月15日采集；果熟期，叶片开始发黄并脱落，于12月15日采集。 1.3 数据处理 利用Design-Expert 8.0 软件对紫苏醛提取率进行多元回归拟合分析，不同紫苏中紫苏醛组间显著差异分析采用软件 SPSS 15.0 进行。
2 结果与分析
2.1 样品溶液中紫苏醛的确定
基于“1.2.1.2”HPLC色谱条件，对比紫苏醛对照品和紫苏叶样品溶液色谱峰的保留时间（图2）可知，紫苏醛的保留时间为 6.023 min。该试验流动相为甲醇∶水=78∶22，流速1.0 mL/min，与文献[13] 乙腈水 （体积比75∶25，流速0.5 mL/min，紫苏醛保留时间为 6.576 min）、文献[14]甲醇水 （体积比72∶28，流速1.3 mL/min，紫苏醛保留时间为 13.10 min，）做流动相相比，该方法快速、成本低、毒性小。
2.2 紫苏叶中紫苏醛提取条件的优化
2.2.1 标准曲线绘制。以紫苏醛对照品的质量浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=36.181X-8.120 9（R2=0.999 7，n=7），表明浓度在5.76～368.64 μg/mL线性关系良好。
2.2.2 方法学考察。精密吸取对照品溶液，连续进样6次，紫苏醛峰面积RSD为0.79%，可见仪器精密度较高；同一样品溶液，分别于2、4、8、16、24、48 h测定，紫苏醛峰面积RSD为1.07%，表明样品溶液在48 h内稳定性良好；向5个1.0 mL已知浓度的样品溶液分别加入3、6、12、24、48 μL对照品储备液，测得平均回收率为99.74%，RSD为1.05%。
2.2.3 单因素试验。
参照《中国药典》（2015版），选择甲醇为提取剂，超声辅助提取，考察提取温度、提取时间、料液比、提取次数4个因素对紫苏醛提取率的影响。如图3所示，当温度从25 ℃上升至35 ℃时，紫苏醛的提取率明显增加，在35～55 ℃，提取率没有明显变化，考虑节省成本，设定温度为35 ℃；在提取时间5～15 min，提取率不断增加，随着时间的延长，提取率变化不明显；料液比对紫苏醛提取的作用，与提取时间对提取率的影响有类似的变化规律；随着提取次数的增加，提取率显著下降，第1次提取紫苏醛得率为95.31%，因此选择提取1次。
试验结果表明，提取温度在35～55 ℃对紫苏醛提取率影响不大，第1次提取得率为95.31%，所以确定提取温度为35 ℃，提取次数为1次。料液比和提取时间对紫苏醛提取率有较大的影响，因此确定料液比和提取时间2个单因素为响应分析待优化因素。
2.2.4 提取条件优化。
利用CCD设计法，以料液比（A）和提取时间（B）2个单因素为待优化因素，进行响应面优化设计，方案与结果如表2所示。
利用Design-Expert 8.0 软件对表2中紫苏醛提取率数据进行多元回归拟合分析，得出二次回归方程为Y=7.15-2.34×10-3A-0.013B+8.28×10-4AB-7.58×10-5 A2-1.03×10-4 B2。方程方差分析结果表明，该模型具有显著性（P<0.01），且失拟项不显著 （P=0.095 0），说明该模型适宜；决定系数R2=0.931 1，表明方程相关性良好；变异系数为0.72%，说明试验操作稳定，模拟方程能较好地反映真实的试验值。B、AB两项P<0.05，说明提取时间、提取时间和料液比的交互作用对紫苏醛提取有显著的影响。
图4是根据回归方程绘出的以紫苏醛为响应值、提取时间和料液比对紫苏醛提取效率影响的响应曲面。 通过分析，紫苏醛提取的最佳条件是：料液比1∶57.9，提取时间23.6 min，在此条件下，提取率可达7.511 mg/g。根据实际情况，以料液比1∶60、提取时间24 min，其他条件与优化设计方案中一致，平均提取3次，对预测结果进行验证，试验值达7.517 mg/g，与响应面优化得到的方程理论预测值相吻合。
从单因素试验和响应面优化设计的结果可以得出，以甲醇为提取剂，紫苏醛提取率为响应值，超声（频率40 kHz，功率300 W）辅助提取的最佳条件为提取温度35 ℃、时间24 min、料液比1∶60、提取1次。
2.3 4种紫苏及其不同部位紫苏醛含量的比较 采用响应面优化得到的最佳提取条件，对4种紫苏（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛进行提取。结果表明（表3），同一紫苏茎、叶、果萼、籽中紫苏醛含量均有显著差异（ P<0.05），且叶>果萼>莖>籽，主要集中在叶和果萼中，籽中含量极少；4种紫苏叶、果萼的紫苏醛含量差异显著（P<0.05），FMPF1、FPF4紫苏叶中紫苏醛含量分别为7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分别为3.712和3.887 mg/g。因此，仅从紫苏醛的含量用药来考虑，可凭紫苏叶的外部形态来判断，FMPF1和FMPF4最佳，FMPF2、FMPF3次之；用药部位选择叶最理想，果萼次之。
魏长玲等[15]对河南、河北、重庆、安徽、四川、甘肃等国内紫苏主产地区43份样品叶中紫苏醛检测显示，其中21份没有检测到紫苏醛；张琛武[16]对38份样品叶中紫苏醛进行检测，仅4份样品检测到紫苏醛，同时对9种含紫苏醛的紫苏叶检测显示，各种质的紫苏醛平均含量在0.5 ～ 3.0 mg/g，最高含量为6.6 mg/g；耿榕徽等[13]利用不同方法提取河北承德紫苏叶中紫苏醛，检测结果紫苏醛最高含量为3.89 mg/g。该研究显示梵净山紫苏叶中紫苏醛平均含量在1.848 ～7.537 mg/g，果萼中平均含量在0.554 ～3.887 mg/g。可见梵净山紫苏（FMPF1、FMPF4）是紫苏醛提取的优质资源，同时提示紫苏醛含量与叶型具有一定的相关性。 2.4 不同生长时期紫苏叶中紫苏醛含量的变化 对4种紫苏营养期、开花期和果熟期3个不同生长时期的叶中紫苏醛含量测定如表4所示，同一紫苏不同生长时期的叶中紫苏醛含量均有显著性差异（P< 0.05），变化规律为开花期>营养期>
果熟期。因此，仅从紫苏醛的含量用药来考虑，选择开花期前后采摘紫苏叶为最佳时期，同时提示果熟期的老叶也具有较高的药用价值。
3 结论
该研究建立了高效液相色谱快速检测紫苏中紫苏醛的方法，流动相为甲醇∶水=78∶22，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，紫苏醛的保留时间为 6 min左右，与文献[13-14]报道的相比，该方法快速、成本低、毒性小。
在单因素试验结果的基础上，以甲醇为提取剂，紫苏醛提取率为响应值，对紫苏醛提取率影响较大的料液比、提取时间进行响应面法优化，采用两因素三水平的CCD设计，其他条件固定为超声提取温度35 ℃、提取1次、频率40 kHz、功率300 W，最优条件为料液比1∶60、提取时间24 min，试验值达7.517 mg/g。
对梵净山4种紫苏（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛检测结果显示，同一紫苏茎、叶、果萼、 籽中紫苏醛含量均有显著差异（P<0.05），主要集中在叶和果萼中；4种紫苏叶、果萼的紫苏醛含量差异显著（P<0.05），FMPF1、FPF4紫苏叶中紫苏醛含量分别为7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分别为3.712、3.887 mg/g。与文献报道相比[13，15-16]，梵净山紫苏（FMPF1、FMPF4）是紫苏醛提取的优质资源。仅从紫苏醛的含量用药来考虑，紫苏醛含量与叶型具有一定的相关性，可凭紫苏叶的外部形态来判断，其变化规律为FMPF1>FMPF4>FMPF2>FMPF3；用药部位选择叶最理想，果萼次之；同时选择开花期前后采摘紫苏叶为最佳时期。这一结果为梵净山紫苏资源利用与开发提供了科学的理论依据。
参考文献
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[16] 张琛武.紫苏醛型紫苏种质筛选及紫苏醛含量变化规律研究[D].太源：山西医科大学，2017.
关键词 梵净山；紫苏；紫苏醛；不同部位；响应面法
中图分类号 R282 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）08-0174-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.046
Abstract [Objective] The content of perillaldehyde in stems，leaves，fruit calyx and seeds of four kinds of Perilla frutescens from Fanjin Mountain （FMPF） was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.[Method]Based on the single factor test results，taking methyl alcohol as the extraction solvent，solidliquid ratio and extraction time were considered for the further optimized using response surface method （RSM） when perillaldehyde content（PAC）was used as response.And other ultrasonic conditions were fixed for extraction temperature 35 ℃，times of 1，frequency 40 kHz，power 300 W.Perillaldehyde from four parts of P.frutescens were extracted under optimal conditions and determined by HPLC.[Result] The optimum conditions were obtained as follows：solidliquid ratio 1∶60，extraction time 24 min.PAC in stems，leaves，fruit calyx and seeds of the same P.frutescens were significantly differences （P<0.05），leaves>fruit calyx>stems>seeds.PAC in leaves or fruit calyx between 4 kinds of P.frutescens also had significant differences （P<0.05），and PAC in leaves of FMPF1（broad ovate，purplish on both sides leaves and its margin is shallow sawtooth）or FMPF4（ovate，purplish on both sides leaves and its margin is deep sawtooth）were 7.537 and 6.139 mg/g，respectively，and PAC of their fruit calyx is 3.712 and 3.887 mg/g，respectively.[Conclusion] The P.frutescens （FMPF1，FMPF4） from Fanjing Mountain is a good resource for extracting perillaldehyde.Simultaneously，it is suggested that there is a correlation between leaf morphology and PAC.
Key words Fanjing Mountain；Perilla frutescens；Perillaldehyde；Different parts；Response surface method
紫蘇 （Perilla frutescens）属于唇形科紫苏属一年生草本植物，有1种3变种，分别为紫苏原变种、野生紫苏、耳齿紫苏、回回苏，其叶、茎、籽均可入药[1-2]。紫苏醛是一种单萜类化合物，是紫苏叶挥发油的主要成分和特征香气成分，广泛地应用于食用香料配方和日用香精配方[3]。《中国药典》规定：紫苏叶应使用紫苏醛型药材，藿香正气口服液的紫苏叶挥发油中紫苏醛的含量不低于25%；日本药局方规定紫苏叶中紫苏醛的含量不得少于0.08%。现代药理试验表明，紫苏醛具有抗衰老、降血脂、抗炎症、抗抑郁、增强免疫、抑菌抗肿瘤等功能[4-11]。可见，紫苏醛是紫苏叶挥发油中主要的一种活性物质。 梵净山是武陵山脉的主峰，蕴含着丰富的紫苏资源[12]，然而针对贵州梵净山紫苏（FMPF）紫苏醛含量的研究鲜见报道。笔者利用高效液相色谱测定梵净山4种紫苏茎、叶、果萼和籽4个部位紫苏醛的含量，并揭示紫苏醛的含量与紫苏叶型的相关性，为梵净山紫苏资源的利用与开发提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。梵净山紫苏（FMPF）由铜仁职业技术学院梁玉勇教授鉴定。FMPF1：叶阔卵形，先端短尖，基部圆形或阔锲形，上面紫绿，背面紫色，边缘锯齿；FMPF2：叶阔卵形，基部圆形或阔锲形，两面绿色，边缘锯齿； FMPF3：叶卵形，先端长而尖，基部圆形或阔锲形，上面绿，背面紫绿色，边缘具粗锯齿； FMPF4：叶卵形，先端长而尖，基部圆形或阔锲形，上面紫绿，背面紫色，具狭而深锯齿。样品图如图1所示。 2017年11月在梵净山收集种子，2018年3月播种于铜仁市漾头镇，12月15日收获，自然晾干茎、叶、果萼、种子。
1.1.2 仪器。Agilent1100高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）；色谱柱 Agilent 5 TC C18（2） 150 mm×4.6 mm；电子精密分析天平CPA225D（赛多利斯斯泰迪有限公司）； 粉碎机RRHP-100（上海菲力博实业有限公司）；旋转蒸发器RE-52AA （上海亚荣生化仪器厂）；超声波清洗机SB52000 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；超纯水仪New Human Power Ⅰ （Human Corporation）。
1.1.3 试剂。紫苏醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111806-201806，纯度≥ 95.7% ）、甲醇（色谱纯，Tedia Company，Inc.）、超纯水（自制）。
1.2 方法
1.2.1 紫苏醛的测定方法。
1.2.1.1 样品溶液的制备。将紫苏叶（FMPF1）药材粉碎，粉末过40目，精密称定1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40 mL，于35 ℃水浴中超声提取 10 min（频率40 kHz， 功率300 W），提取液过滤，滤液旋干，甲醇定容至10 mL。
1.2.1.2 色谱条件。色谱柱为Agilent 5 TC C18（2） 150 mm×4.6 mm，流动相为甲醇∶水（78∶22），流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。
1.2.1.3 标准曲线的绘制。精密移取200 μL紫苏醛对照品，用甲醇定容至10 mL，得到20 μL/mL紫苏醛对照品储备液（紫苏醛密度为0.96 g/mL）。精密吸取3、6、12、24、48、96、192 μL紫苏醛对照品储备液，分别置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。按“1.2.1.2”色谱条件测定紫苏醛的含量，以对照品紫苏醛的质量浓度X（μg/mL）和峰面积Y绘制回归曲线。
1.2.1.4 精密度。同一对照品溶液，连续进样6次，记录紫苏醛峰面积。
1.2.1.5 稳定性。同一紫苏样品溶液，在2、4、8、16、24、48 h记录紫苏醛峰面积。
1.2.1.6 回收率。向5个1.0 mL已知浓度的样品溶液分别加入3、6、12、24、48 μL对照品储备液，测定加样回收率。
1.2.2 单因素试验。
1.2.2.1 提取温度对紫苏醛提取率的影响。称取4份0.5 g紫苏叶，以料液比1∶60（m∶V） 加入甲醇溶液，分别在25、35、45和55 ℃的条件下，以频率40 kHz、功率300 W超声提取10 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.2.2 料液比对紫苏醛提取率的影响。称取4份0.5 g紫苏叶，分别以料液比1∶40、1∶60、1∶80、1∶100加入甲醇溶液，以温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W超声提取10 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.2.3 提取时间对紫苏醛提取率的影响。
称取4份0.5 g紫苏叶，以料液比1∶60加入甲醇溶液，以温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W超声分别提取5、10、15、20 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.2.4 提取次数对紫苏醛提取率的影响。
称取一份0.5 g紫苏叶，以料液比1∶60加入甲醇溶液，以温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W超声提取3次，每次10 min，提取液过滤后浓缩旋干，用甲醇定容至10 mL。
1.2.3 響应面优化设计。
在单因素试验结果的基础上，选出对紫苏醛提取效果影响较大的2个因素进行响应面优化。其他条件固定为提取次数1次、温度35 ℃、频率40 kHz、功率300 W。采用两因素三水平的中心组合设计（central composite design，CCD），如表1所示。以紫苏醛提取率为响应值，利用Design-Expent 8.0软件进行数据分析，得出紫苏醛的最优提取条件，并对其进行验证。
1.2.4 4种紫苏及其不同部位紫苏醛含量的比较。
采用响应面优化分析得到的以紫苏醛提取率为响应值的最佳提取条件，对4种紫苏（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛进行提取，并采用“1.2.1.2”HPLC色谱分析方法对紫苏醛进行含量测定。
1.2.5 不同生长时期紫苏叶中紫苏醛含量的变化。
以最佳的提取条件对4种紫苏3个不同生长时期的叶中紫苏醛含量进行测定。营养生长期，茎叶生长旺盛，简称营养期，于8月17日采集；开花期，于10月15日采集；果熟期，叶片开始发黄并脱落，于12月15日采集。 1.3 数据处理 利用Design-Expert 8.0 软件对紫苏醛提取率进行多元回归拟合分析，不同紫苏中紫苏醛组间显著差异分析采用软件 SPSS 15.0 进行。
2 结果与分析
2.1 样品溶液中紫苏醛的确定
基于“1.2.1.2”HPLC色谱条件，对比紫苏醛对照品和紫苏叶样品溶液色谱峰的保留时间（图2）可知，紫苏醛的保留时间为 6.023 min。该试验流动相为甲醇∶水=78∶22，流速1.0 mL/min，与文献[13] 乙腈水 （体积比75∶25，流速0.5 mL/min，紫苏醛保留时间为 6.576 min）、文献[14]甲醇水 （体积比72∶28，流速1.3 mL/min，紫苏醛保留时间为 13.10 min，）做流动相相比，该方法快速、成本低、毒性小。
2.2 紫苏叶中紫苏醛提取条件的优化
2.2.1 标准曲线绘制。以紫苏醛对照品的质量浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=36.181X-8.120 9（R2=0.999 7，n=7），表明浓度在5.76～368.64 μg/mL线性关系良好。
2.2.2 方法学考察。精密吸取对照品溶液，连续进样6次，紫苏醛峰面积RSD为0.79%，可见仪器精密度较高；同一样品溶液，分别于2、4、8、16、24、48 h测定，紫苏醛峰面积RSD为1.07%，表明样品溶液在48 h内稳定性良好；向5个1.0 mL已知浓度的样品溶液分别加入3、6、12、24、48 μL对照品储备液，测得平均回收率为99.74%，RSD为1.05%。
2.2.3 单因素试验。
参照《中国药典》（2015版），选择甲醇为提取剂，超声辅助提取，考察提取温度、提取时间、料液比、提取次数4个因素对紫苏醛提取率的影响。如图3所示，当温度从25 ℃上升至35 ℃时，紫苏醛的提取率明显增加，在35～55 ℃，提取率没有明显变化，考虑节省成本，设定温度为35 ℃；在提取时间5～15 min，提取率不断增加，随着时间的延长，提取率变化不明显；料液比对紫苏醛提取的作用，与提取时间对提取率的影响有类似的变化规律；随着提取次数的增加，提取率显著下降，第1次提取紫苏醛得率为95.31%，因此选择提取1次。
试验结果表明，提取温度在35～55 ℃对紫苏醛提取率影响不大，第1次提取得率为95.31%，所以确定提取温度为35 ℃，提取次数为1次。料液比和提取时间对紫苏醛提取率有较大的影响，因此确定料液比和提取时间2个单因素为响应分析待优化因素。
2.2.4 提取条件优化。
利用CCD设计法，以料液比（A）和提取时间（B）2个单因素为待优化因素，进行响应面优化设计，方案与结果如表2所示。
利用Design-Expert 8.0 软件对表2中紫苏醛提取率数据进行多元回归拟合分析，得出二次回归方程为Y=7.15-2.34×10-3A-0.013B+8.28×10-4AB-7.58×10-5 A2-1.03×10-4 B2。方程方差分析结果表明，该模型具有显著性（P<0.01），且失拟项不显著 （P=0.095 0），说明该模型适宜；决定系数R2=0.931 1，表明方程相关性良好；变异系数为0.72%，说明试验操作稳定，模拟方程能较好地反映真实的试验值。B、AB两项P<0.05，说明提取时间、提取时间和料液比的交互作用对紫苏醛提取有显著的影响。
图4是根据回归方程绘出的以紫苏醛为响应值、提取时间和料液比对紫苏醛提取效率影响的响应曲面。 通过分析，紫苏醛提取的最佳条件是：料液比1∶57.9，提取时间23.6 min，在此条件下，提取率可达7.511 mg/g。根据实际情况，以料液比1∶60、提取时间24 min，其他条件与优化设计方案中一致，平均提取3次，对预测结果进行验证，试验值达7.517 mg/g，与响应面优化得到的方程理论预测值相吻合。
从单因素试验和响应面优化设计的结果可以得出，以甲醇为提取剂，紫苏醛提取率为响应值，超声（频率40 kHz，功率300 W）辅助提取的最佳条件为提取温度35 ℃、时间24 min、料液比1∶60、提取1次。
2.3 4种紫苏及其不同部位紫苏醛含量的比较 采用响应面优化得到的最佳提取条件，对4种紫苏（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛进行提取。结果表明（表3），同一紫苏茎、叶、果萼、籽中紫苏醛含量均有显著差异（ P<0.05），且叶>果萼>莖>籽，主要集中在叶和果萼中，籽中含量极少；4种紫苏叶、果萼的紫苏醛含量差异显著（P<0.05），FMPF1、FPF4紫苏叶中紫苏醛含量分别为7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分别为3.712和3.887 mg/g。因此，仅从紫苏醛的含量用药来考虑，可凭紫苏叶的外部形态来判断，FMPF1和FMPF4最佳，FMPF2、FMPF3次之；用药部位选择叶最理想，果萼次之。
魏长玲等[15]对河南、河北、重庆、安徽、四川、甘肃等国内紫苏主产地区43份样品叶中紫苏醛检测显示，其中21份没有检测到紫苏醛；张琛武[16]对38份样品叶中紫苏醛进行检测，仅4份样品检测到紫苏醛，同时对9种含紫苏醛的紫苏叶检测显示，各种质的紫苏醛平均含量在0.5 ～ 3.0 mg/g，最高含量为6.6 mg/g；耿榕徽等[13]利用不同方法提取河北承德紫苏叶中紫苏醛，检测结果紫苏醛最高含量为3.89 mg/g。该研究显示梵净山紫苏叶中紫苏醛平均含量在1.848 ～7.537 mg/g，果萼中平均含量在0.554 ～3.887 mg/g。可见梵净山紫苏（FMPF1、FMPF4）是紫苏醛提取的优质资源，同时提示紫苏醛含量与叶型具有一定的相关性。 2.4 不同生长时期紫苏叶中紫苏醛含量的变化 对4种紫苏营养期、开花期和果熟期3个不同生长时期的叶中紫苏醛含量测定如表4所示，同一紫苏不同生长时期的叶中紫苏醛含量均有显著性差异（P< 0.05），变化规律为开花期>营养期>
果熟期。因此，仅从紫苏醛的含量用药来考虑，选择开花期前后采摘紫苏叶为最佳时期，同时提示果熟期的老叶也具有较高的药用价值。
3 结论
该研究建立了高效液相色谱快速检测紫苏中紫苏醛的方法，流动相为甲醇∶水=78∶22，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，紫苏醛的保留时间为 6 min左右，与文献[13-14]报道的相比，该方法快速、成本低、毒性小。
在单因素试验结果的基础上，以甲醇为提取剂，紫苏醛提取率为响应值，对紫苏醛提取率影响较大的料液比、提取时间进行响应面法优化，采用两因素三水平的CCD设计，其他条件固定为超声提取温度35 ℃、提取1次、频率40 kHz、功率300 W，最优条件为料液比1∶60、提取时间24 min，试验值达7.517 mg/g。
对梵净山4种紫苏（FMPF1、FMPF2、FMPF3、FMPF4）茎、叶、果萼和籽4个部位中紫苏醛检测结果显示，同一紫苏茎、叶、果萼、 籽中紫苏醛含量均有显著差异（P<0.05），主要集中在叶和果萼中；4种紫苏叶、果萼的紫苏醛含量差异显著（P<0.05），FMPF1、FPF4紫苏叶中紫苏醛含量分别为7.537和6.139 mg/g，果萼中的含量分别为3.712、3.887 mg/g。与文献报道相比[13，15-16]，梵净山紫苏（FMPF1、FMPF4）是紫苏醛提取的优质资源。仅从紫苏醛的含量用药来考虑，紫苏醛含量与叶型具有一定的相关性，可凭紫苏叶的外部形态来判断，其变化规律为FMPF1>FMPF4>FMPF2>FMPF3；用药部位选择叶最理想，果萼次之；同时选择开花期前后采摘紫苏叶为最佳时期。这一结果为梵净山紫苏资源利用与开发提供了科学的理论依据。
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