【摘 要】
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目的 克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子(Rpf)结构域及其突变体基因,评价其生物学活性.方法 采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K,用限
【机 构】
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第四军医大学西京医院呼吸科,西安,710032;第四军医大学实验动物中心
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目的 克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子(Rpf)结构域及其突变体基因,评价其生物学活性.方法 采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K,用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中,将测序正确的基因插入到pGEx-4T-1表达载体中,转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-B-D硫代半乳糖(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达蛋白,利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析.用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白,将纯化的蛋白加人到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性.结果 获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因,测序结果 与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同,突变位点与设定一致;表达蛋白相对分子质量与文献报道一致;Western blot结果 显示,在相对分子质量约32 000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带.通过GS-4B系统,得到纯化的GST融合蛋白,并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用,突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用.结论 获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白,明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用.
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