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摘 要 利用相关序列扩增多态性（SRAP）标记对巴山脆李及达州地区优良脆李资源进行亲缘关系分析，为巴山脆李品种的鉴定和其他李资源的保护及利用提供理论依据。从180对引物组合中筛选出12对多态性高、扩增谱带清晰的SRAP引物，对22份李资源进行扩增，共获得103条谱带，其中多态性谱带64条，多态性比率为60.34%。平均每对引物组合扩增出多态性谱带5.42条。利用UPGMA法构建树状聚类图，在相似性系数0.68处可将22份样品分成3组。聚类结果与按果形分类结果一致，与其地理位置和熟期也存在一定的相关性。
关键词 李；亲缘关系；SRAP分析
中图分类号 S662.3 文献标识码 A
李是蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物。为开发、保护和利用李资源，1992年达州地区对李树进行调查，通过果实品质的评价初步筛选出65个比较优良的变异单系，再对65个变异单系的物候期、生长结果习性等进行调查测试，进一步筛选出22个优异变异单系。从22个变异单系中审定了‘巴山脆李’品种。‘巴山脆李’[1]是达州地区‘青脆李’变异单系，来源于1株60余年的青脆李树，在果形、平均单果质量、成熟期上发生变异。为进一步选育新品种，了解当地资源的遗传基础与差异，需对亲缘关系进行分析研究。
国内外学者曾从农艺性状[2]、孢粉学[3]、RAPD分子标记[4]、SSR分子标记[5]、ISSR分子标记[6]等不同侧面对李遗传变异进行分析，研究中国李种质资源亲缘关系，但存在一定的分歧。Li和Quiros[7]根据基因中外显子富含CG，而内含子和启动子富含AT的特点开发出独特的双引物设计对基因的ORFs（Open reading frames）的特定区域进行扩增的SRAP分子标记。目前SRAP分子标记在属内种间[8]，种内品种间[9]亲缘关系鉴定中运用广泛，并且在亲缘关系很近的种内鉴定中表现优良[10]，但SRAP在中国李中的应用未见报道。笔者利用SRAP分子标记对22份李资源进行分析，旨在为巴山脆李品种的分子鉴定和其它李资源的保护和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
参照谢志亮等[13]的方法从新鲜幼嫩叶片中提取李基因组DNA。DNA用Bio-Photometer核酸检测仪检测浓度，将纯化的DNA稀释到100 ng/μL备用。
反应体系以Li与Qurio[7]提出的体系以及前人[12]在桃中建立优化SRAP-PCR体系为参照，在25 μL体系中，Taq DNA聚合酶0.4 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，模板DNA 45 ng，dNTPs 200 μmol/L，引物0.75 μmol/L。扩增程序是94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性 1 min，72 ℃延伸90 s，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保持扩增结束后，取6 μL扩增产物，在2%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液1×TBE（0.09 mmol/L Tris，0.002 mmol/L乙酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0），电压90 V电泳2 h，以100 bp DNA Ladder作为分子量标记，EB染色后在SYNGENE凝胶成像系统上观察并拍照记录。
1.3 数据处理与分析
利用Gel-Pro analyzer软件获取原始数据，电泳图谱上有条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，从而生成由“1”和“0”组成的原始矩阵。计算多态性信息含量（Polymorphism information content）PIC=1-ΣPi2[14]。用NTSYS-pc 2.10（numerical taxonomy and multivariate analysissystem，NTSYS）[15]软件进行SM相似系数计算和基于UPGMA算法的聚类分析。
2 结果与分析
2.1 SRAP扩增产物多态性及亲缘关系分析
2.2 基于SRAP标记的聚类分析
从在相似系数SM=0.72处可将材料分为8组。巴山脆李、通川6号、通川7号各单独分为一组，从分子水平上证实了巴山脆李品种与其他资源材料间存在遗传差异。来自通川的资源除通川4号与通川8号全部分为一组，万源的资源除万源4号全部分为一组，表现出与果实成熟期相似的趋势。其中巴山脆李和达县1号相似系数为0.477 2，亲缘关系最远。从选配亲本的角度考虑，这两种资源遗传基础较宽，亲缘关系较远，进行杂交来进行遗传改良的潜力大。通川8号和万源1号相似系数为0.840 9，亲缘关系最近，生活在不同县区，可能来源于同一亲本。
大竹鸡心李作为22分材料中唯一果肉为红色的材料，在聚类分析中并没有单独成为一类，而是与来源地相同的其他材料聚为一类。表明李种质资源的分类与果肉颜色无明显的相关性。
3 讨论与结论
3.1 SRAP在李资源分析中应用的可行性
国内外学者研究表明，SRAP在形态学变异和形态学发展史上比AFLP更具有一致性[9]；比RAPD表现更稳定[16]，更有利于遗传育种评价；扩增的条带数和多态性位点数[17]更丰富；能够更好地区分近源种[18]。SRAP是评价遗传多样性、品种鉴定有效的手段。本研究表明，SRAP分子标记用不同引物扩增出的条带清晰，条带多形态性信息含量丰富，进行UPGMA法聚类分析，同一果形的变异单系聚为一类，分类结果与果形相符，具有近似熟期的变异单系以及在同一地理位置的变异单系基本聚在一起，分类结果与熟期、资源地理分布基本相符，说明SRAP用于探讨巴山脆李及达州地区优良脆李资源间的亲缘关系是可行的，能够在探讨中国李亲缘关系中进行应用。 3.2 李种质间的亲缘关系
巴山脆李是青脆李的实生变异通过审定的品种[1]。经过多年观察比较，该品种比亲本青脆李成熟期延后约30 d；果实为圆形，果顶微凹，而青脆李果形为扁圆形，果顶平；果实较大，平均单果重约40 g，而亲本‘青脆李’的平均单果质量只有30 g左右；在达州海拔700 m的地方栽植，果实于8月中旬成熟，在自然条件下，果实货架期可达10 d左右。本实验分子标记结果显示，来自同一县区的种质资源聚在一起，表明巴山脆李与通川区其他种质有着较近的亲缘关系，但在相似系数SM=0.72处巴山脆李从通川区种质中分离出来，独立成为一组，表明巴山脆李的基因水平虽然与通川区其他种质相似，但也存在部分差异。对巴山脆李遗传背景的研究，笔者认为可结合SRAP分子标记技术和其他分子标记对通川区其他种质资源和巴山脆李做进一步分析。同一县区的种质资源亲缘关系较近，推测是来源比较近或长期实生繁殖的原因，显示出较近的遗传距离，应适当引入国内外优质李品种，扩大当地李资源的遗传多样性，降低生态系统性风险。
3.3 本实验存在的不足
聚类结果显示通川8号与万源1号有着很近的亲缘关系。但通川8号来源于达州市通川区海拔300 m左右的低海拔地区，于8月中下旬成熟，属于中熟或中晚熟种质资源，万源1号来源于万源市海拔1 000 m左右的地区，是9月中下旬成熟的晚熟种质。通川8号的平均单果质量明显大于万源1号。两者局部外部形态学差异可能来源于外界生存环境条件差异，或者是变异差异点检测不完全，这还需要进一步探讨。
参考文献
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[18] Riaz Ahmad， Dan Potter， Stephen M S. Genotyping of Peach and Nectarine cultivars with SSR and SRAP Molecular makers[J]. Journal of the American Society for Horticulture Science， 2004， 129（2）： 204-210.
关键词 李；亲缘关系；SRAP分析
中图分类号 S662.3 文献标识码 A
李是蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物。为开发、保护和利用李资源，1992年达州地区对李树进行调查，通过果实品质的评价初步筛选出65个比较优良的变异单系，再对65个变异单系的物候期、生长结果习性等进行调查测试，进一步筛选出22个优异变异单系。从22个变异单系中审定了‘巴山脆李’品种。‘巴山脆李’[1]是达州地区‘青脆李’变异单系，来源于1株60余年的青脆李树，在果形、平均单果质量、成熟期上发生变异。为进一步选育新品种，了解当地资源的遗传基础与差异，需对亲缘关系进行分析研究。
国内外学者曾从农艺性状[2]、孢粉学[3]、RAPD分子标记[4]、SSR分子标记[5]、ISSR分子标记[6]等不同侧面对李遗传变异进行分析，研究中国李种质资源亲缘关系，但存在一定的分歧。Li和Quiros[7]根据基因中外显子富含CG，而内含子和启动子富含AT的特点开发出独特的双引物设计对基因的ORFs（Open reading frames）的特定区域进行扩增的SRAP分子标记。目前SRAP分子标记在属内种间[8]，种内品种间[9]亲缘关系鉴定中运用广泛，并且在亲缘关系很近的种内鉴定中表现优良[10]，但SRAP在中国李中的应用未见报道。笔者利用SRAP分子标记对22份李资源进行分析，旨在为巴山脆李品种的分子鉴定和其它李资源的保护和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
参照谢志亮等[13]的方法从新鲜幼嫩叶片中提取李基因组DNA。DNA用Bio-Photometer核酸检测仪检测浓度，将纯化的DNA稀释到100 ng/μL备用。
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1.3 数据处理与分析
利用Gel-Pro analyzer软件获取原始数据，电泳图谱上有条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，从而生成由“1”和“0”组成的原始矩阵。计算多态性信息含量（Polymorphism information content）PIC=1-ΣPi2[14]。用NTSYS-pc 2.10（numerical taxonomy and multivariate analysissystem，NTSYS）[15]软件进行SM相似系数计算和基于UPGMA算法的聚类分析。
2 结果与分析
2.1 SRAP扩增产物多态性及亲缘关系分析
2.2 基于SRAP标记的聚类分析
从在相似系数SM=0.72处可将材料分为8组。巴山脆李、通川6号、通川7号各单独分为一组，从分子水平上证实了巴山脆李品种与其他资源材料间存在遗传差异。来自通川的资源除通川4号与通川8号全部分为一组，万源的资源除万源4号全部分为一组，表现出与果实成熟期相似的趋势。其中巴山脆李和达县1号相似系数为0.477 2，亲缘关系最远。从选配亲本的角度考虑，这两种资源遗传基础较宽，亲缘关系较远，进行杂交来进行遗传改良的潜力大。通川8号和万源1号相似系数为0.840 9，亲缘关系最近，生活在不同县区，可能来源于同一亲本。
大竹鸡心李作为22分材料中唯一果肉为红色的材料，在聚类分析中并没有单独成为一类，而是与来源地相同的其他材料聚为一类。表明李种质资源的分类与果肉颜色无明显的相关性。
3 讨论与结论
3.1 SRAP在李资源分析中应用的可行性
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巴山脆李是青脆李的实生变异通过审定的品种[1]。经过多年观察比较，该品种比亲本青脆李成熟期延后约30 d；果实为圆形，果顶微凹，而青脆李果形为扁圆形，果顶平；果实较大，平均单果重约40 g，而亲本‘青脆李’的平均单果质量只有30 g左右；在达州海拔700 m的地方栽植，果实于8月中旬成熟，在自然条件下，果实货架期可达10 d左右。本实验分子标记结果显示，来自同一县区的种质资源聚在一起，表明巴山脆李与通川区其他种质有着较近的亲缘关系，但在相似系数SM=0.72处巴山脆李从通川区种质中分离出来，独立成为一组，表明巴山脆李的基因水平虽然与通川区其他种质相似，但也存在部分差异。对巴山脆李遗传背景的研究，笔者认为可结合SRAP分子标记技术和其他分子标记对通川区其他种质资源和巴山脆李做进一步分析。同一县区的种质资源亲缘关系较近，推测是来源比较近或长期实生繁殖的原因，显示出较近的遗传距离，应适当引入国内外优质李品种，扩大当地李资源的遗传多样性，降低生态系统性风险。
3.3 本实验存在的不足
聚类结果显示通川8号与万源1号有着很近的亲缘关系。但通川8号来源于达州市通川区海拔300 m左右的低海拔地区，于8月中下旬成熟，属于中熟或中晚熟种质资源，万源1号来源于万源市海拔1 000 m左右的地区，是9月中下旬成熟的晚熟种质。通川8号的平均单果质量明显大于万源1号。两者局部外部形态学差异可能来源于外界生存环境条件差异，或者是变异差异点检测不完全，这还需要进一步探讨。
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[18] Riaz Ahmad， Dan Potter， Stephen M S. Genotyping of Peach and Nectarine cultivars with SSR and SRAP Molecular makers[J]. Journal of the American Society for Horticulture Science， 2004， 129（2）： 204-210.