【摘 要】
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目的筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒,建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23.5细胞系。方法合成三种(分别命名为p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-s
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(31040035)
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目的筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒,建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23.5细胞系。方法合成三种(分别命名为p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-sh Six2-3)含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo,并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的p LV-H1-EF1a载体质粒,均采用慢病毒包装四质粒系统(pRRE/p VSVG/pREV/p LV)包装并转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系(293T细胞)以获取慢病毒p LVsh Six2。收集敲减Six2基因的p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-sh Six2-3慢病毒质粒及对照质粒上清,感染黑质多巴胺能神经元细胞(MES23.5细胞),分别设为p LV-sh Six2-1组、p LV-sh Six2-2组、p LV-sh Six2-3组及对照组,Western blot法检测各组细胞Six2蛋白表达,鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减Six2的MES23.5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9 000 bp处分别有明显条带,测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。Western blot结果显示干扰序列sh Six2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低,sh Six2-1和sh Six2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的p LV-sh Six2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体,建立了稳定敲减Six2基因的MES23.5细胞株。
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