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目的 探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用. 方法 基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL(Py17XL)的PK9序列信息,BLAST比对PyPK9和恶性疟原虫PK9(PfPK9)以及人蛋白激酶p78的同源性.提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物,PCR扩增PK9基因.采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒.重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序.10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验.每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况.200只3～5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只.于吸血8d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量.10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验.每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间. 结果 PyPK9与PfPK9的序列一致性为82.5％,PyPK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4％.PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp.经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功,Py17XL虫株成功敲除PK9基因.WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5～6d全部死亡,PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失.WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0％ (9/15)和66.7％ (10/15),差异无统计学意义(P＞0.05).WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症. 结论 PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用.