研究靶向沉默Notch1基因对人非小细胞肺癌干细胞增殖和凋亡的影响。
方法选取人肺癌A549细胞和SPC-A-1细胞，分为空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组，Nc-shRNA组为阴性对照RNAi慢病毒组，Notch1-shRNA组为Notch1抑制RNAi慢病毒组。采用慢病毒介导的shRNA干扰技术靶向沉默Notch1基因，实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blotting验证Notch1基因的沉默效果；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和成球实验检测细胞增殖能力；采用Annexin V/7-AAD双染法检测细胞凋亡情况；采用Western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)以及Notch1下游基因Hes-1的表达情况。
结果qRT-PCR结果显示A549细胞和SPC-A-1细胞中空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组Notch1相对表达量分别为1.000±0.000、0.937±0.025、0.490±0.036和1.000±0.000、1.077±0.070、0.373±0.038，差异均具有统计学意义(F＝359.707，P<0.001；F＝210.455，P<0.001)，进一步两两比较，两种细胞中Notch1-shRNA组Notch1相对表达量明显低于Nc-shRNA组(均P<0.05)；Western blotting检测A549细胞和SPC-A-1细胞中Notch1蛋白表达的结果与mRNA结果一致。MTT实验显示A549细胞球空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组在24 hA值分别为0.209±0.005、0.219±0.009、0.159±0.006，48 h A值分别为0.293±0.004、0.302±0.004、0.205±0.005，72 h A值分别为0.450±0.003、0.430±0.012、0.348±0.017，差异均具有统计学意义(F＝79.487，P<0.001；F＝508.664，P<0.001；F＝57.156，P<0.001)，进一步两两比较，24、48、72 h Notch1-shRNA组增殖能力明显低于Nc-shRNA组(均P<0.05)；SPC-A-1细胞球空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组在48 h A值为0.438±0.022、0.412±0.015、0.364±0.010，72 h A值为0.540±0.016、0.519±0.009、0.438±0.019，差异均具有统计学意义(F＝15.667，P＝0.004；F＝37.299，P<0.001)，进一步两两比较，48、72 h Notch1-shRNA组增殖能力明显低于Nc-shRNA组(均P<0.05)。空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组A549细胞成球直径分别为(149.667±6.506)μm、(136.667±7.095)μm、(86.676±7.638)μm，差异具有统计学意义(F＝65.940，P<0.001)；SPC-A-1细胞成球直径分别为(118.667±6.658)μm、(128.000±7.000)μm、(60.675±4.509)μm，差异具有统计学意义(F＝105.372，P<0.001)；进一步两两比较，两种细胞Notch1-shRNA组成球大小明显小于Nc-shRNA组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞术检测A549细胞和SPC-A-1细胞空白对照组、Nc-shRNA组、Notch1-shRNA组凋亡率分别为(0.489±0.014)%、(0.633±0.021)%、(1.683±0.221)%和(1.323±0.194)%、(1.690±0.188)%、(3.017±0.356)%，差异均具有统计学意义(F＝77.660，P<0.001；F＝32.200，P＝0.001)，进一步两两比较，两种细胞中Notch1-shRNA组凋亡率明显高于Nc-shRNA组(均P<0.05)。Western blotting显示A549细胞空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组3组间PCNA、Bcl-2、Hes-1表达差异均具有统计学意义(F＝155.343，P<0.001；F＝22.576，P＝0.002；F＝70.108，P<0.001 )，SPC-A-1细胞空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组3组间PCNA、Bcl-2、Hes-1表达差异均具有统计学意义(F＝49.419，P<0.001；F＝28.090，P＝0.001；F＝12.040，P＝0.007)，进一步两两比较，两种细胞PCNA、Bcl-2、Hes-1表达在Notch1-shRNA组明显低于Nc-shRNA组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。
结论靶向沉默Notch1能降低肺癌干细胞增殖活性，促进其凋亡，可能与其下游基因Hes-1下调有关。