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摘要[目的]优化福林试剂法的反应条件。[方法]以从紫外诱变样品中筛选获得的1株高产藤仓赤霉菌（G. fujikuroi） F12为研究对象，采用福林试剂法，通过溶液吸光值的变化定量检测藤仓赤霉菌发酵液中赤霉酸（GA3）的产量。[结果]当福林试剂的用量为1.5 mL、盐酸用量为3.0 mL、加热时间为20 min时，所得溶液吸光值稳定性最好，在4 h以内基本保持不变。[结论]福林试剂法操作简便、检测快速准确，可用于藤仓赤霉菌发酵液中GA3的快速检测。
关键词 赤霉酸；福林试剂；快速检测法；藤仓赤霉菌；吸光值
中图分类号 S13 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）28-0017-02
Abstract[Objective]The aim was to optimize reaction conditions of FolinCiocalteu’s phenol reagent. [Method]With highyield Gibberella fujikuroi F12 as the research strain which was isolated from large quantities of UV mutation samples， FolinCiocalteu’s phenol reagent method was used to quickly detect the gibberellin acid （GA3） yield in Gibberella fujikuroi fermentation broth by the change of absorbance. [Result]When 1.5 mL FolinCiocalteu’s phenol reagent， 3.0 mL hydrochloric acid as well as 20 min heating time was selected， the final solution absorbance had the best stability and still remained basically unchanged within 4 h. [Conclusion]The optimized method can quickly and accurately detect the GA3 yield in Gibberella fujikuroi fermentation broth.
Key words GA3； Folin’s reagent； Quick detection； Gibberella fujikuroi； Absorbance
赤霉酸（GA3）属于生物体内的一类四环二萜类化合物，是一种天然的植物生长调节剂，与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯共称为植物的五大内源激素[1-2]。由于GA3在植物生长周期全过程中可促进与调节各种发育过程，如种子萌发、茎的伸长、性别表达和果实形成等[3-6]，它被广泛应用于农业、林业、酿造业等各个行业，具有很大的经济效益和市场前景。
GA3的化学结构复杂，虽然利用化学合成法也能生产GA3，但是存在步骤繁琐、副产物多、分离困难等问题，导致GA3价格非常高[7]。目前，GA3的工业化生产还是依赖于高产藤仓赤霉菌（G. fujikuroi）作为发酵菌种的液体深层发酵法[8]。但GA3的工业化发酵产量较低，导致GA3一直无法进行大规模应用。为了进一步提高GA3产量，大量的研究工作都围绕着赤霉菌的诱变和筛选进行。但是诱变筛菌操作繁琐，诱变得到的菌株数量非常多，如果仅仅依靠液相色谱法进行含量测定，每天只能测定70多个菌，工作量极大[9-10]。目前，关于福林试剂法快速检测GA3含量的研究已有报道[11-13]，而且效果较好，可以对赤霉菌发酵液中的GA3进行较精确的测量。该方法比较简单，在酶标仪的操作下1 d可对上千个样品进行快速测定，从而节省大量时间。由于福林试剂与浓盐酸的用量以及加热时间不仅影响反应后的吸光值，同时还影响吸光值的稳定性，笔者采用福林试剂法快速检测藤仓赤霉菌发酵液中GA3含量，对该方法进行了进一步优化，旨在为突变菌株的大规模筛选奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 出发菌株。
藤仓赤霉菌F12，为江西新瑞丰生化有限公司实验室紫外诱变筛选获得。
1.1.2 试剂。
GA3标准品、福林试剂、无水乙醇（分析纯）、37%浓盐酸均购自Sigma试剂公司。
1.1.3 培养基。种子培养基：30.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氢钾，0.20 g/L硫酸镁，pH自然，115 ℃下灭菌30 min。
发酵培养基：60.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氢钾，0.20 g/L硫酸镁，100 μL微量元素（0.10 g/L CaCl2，0.10 g/L FeCl3， 0.05 g/L MnCl2），pH自然，115 ℃下灭菌30 min。
1.2 方法
1.2.1 发酵样品处理。
取3.0 mL发酵后菌液，先用滤纸过滤得到较澄清的滤液，然后用0.22 μm滤头对滤液进行过膜处理，得到澄清样品，再进行高效液相色谱（HPLC）分析。
1.2.2 HPLC测定GA3含量。
标准C18液相色谱柱250.0 mm×4.6 mm；紫外检测波长210 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL；流动相为100%甲醇与0.05%磷酸；柱温28 ℃。
1.2.3 标准曲线的建立。
关键词 赤霉酸；福林试剂；快速检测法；藤仓赤霉菌；吸光值
中图分类号 S13 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）28-0017-02
Abstract[Objective]The aim was to optimize reaction conditions of FolinCiocalteu’s phenol reagent. [Method]With highyield Gibberella fujikuroi F12 as the research strain which was isolated from large quantities of UV mutation samples， FolinCiocalteu’s phenol reagent method was used to quickly detect the gibberellin acid （GA3） yield in Gibberella fujikuroi fermentation broth by the change of absorbance. [Result]When 1.5 mL FolinCiocalteu’s phenol reagent， 3.0 mL hydrochloric acid as well as 20 min heating time was selected， the final solution absorbance had the best stability and still remained basically unchanged within 4 h. [Conclusion]The optimized method can quickly and accurately detect the GA3 yield in Gibberella fujikuroi fermentation broth.
Key words GA3； Folin’s reagent； Quick detection； Gibberella fujikuroi； Absorbance
赤霉酸（GA3）属于生物体内的一类四环二萜类化合物，是一种天然的植物生长调节剂，与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯共称为植物的五大内源激素[1-2]。由于GA3在植物生长周期全过程中可促进与调节各种发育过程，如种子萌发、茎的伸长、性别表达和果实形成等[3-6]，它被广泛应用于农业、林业、酿造业等各个行业，具有很大的经济效益和市场前景。
GA3的化学结构复杂，虽然利用化学合成法也能生产GA3，但是存在步骤繁琐、副产物多、分离困难等问题，导致GA3价格非常高[7]。目前，GA3的工业化生产还是依赖于高产藤仓赤霉菌（G. fujikuroi）作为发酵菌种的液体深层发酵法[8]。但GA3的工业化发酵产量较低，导致GA3一直无法进行大规模应用。为了进一步提高GA3产量，大量的研究工作都围绕着赤霉菌的诱变和筛选进行。但是诱变筛菌操作繁琐，诱变得到的菌株数量非常多，如果仅仅依靠液相色谱法进行含量测定，每天只能测定70多个菌，工作量极大[9-10]。目前，关于福林试剂法快速检测GA3含量的研究已有报道[11-13]，而且效果较好，可以对赤霉菌发酵液中的GA3进行较精确的测量。该方法比较简单，在酶标仪的操作下1 d可对上千个样品进行快速测定，从而节省大量时间。由于福林试剂与浓盐酸的用量以及加热时间不仅影响反应后的吸光值，同时还影响吸光值的稳定性，笔者采用福林试剂法快速检测藤仓赤霉菌发酵液中GA3含量，对该方法进行了进一步优化，旨在为突变菌株的大规模筛选奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 出发菌株。
藤仓赤霉菌F12，为江西新瑞丰生化有限公司实验室紫外诱变筛选获得。
1.1.2 试剂。
GA3标准品、福林试剂、无水乙醇（分析纯）、37%浓盐酸均购自Sigma试剂公司。
1.1.3 培养基。种子培养基：30.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氢钾，0.20 g/L硫酸镁，pH自然，115 ℃下灭菌30 min。
发酵培养基：60.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氢钾，0.20 g/L硫酸镁，100 μL微量元素（0.10 g/L CaCl2，0.10 g/L FeCl3， 0.05 g/L MnCl2），pH自然，115 ℃下灭菌30 min。
1.2 方法
1.2.1 发酵样品处理。
取3.0 mL发酵后菌液，先用滤纸过滤得到较澄清的滤液，然后用0.22 μm滤头对滤液进行过膜处理，得到澄清样品，再进行高效液相色谱（HPLC）分析。
1.2.2 HPLC测定GA3含量。
标准C18液相色谱柱250.0 mm×4.6 mm；紫外检测波长210 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL；流动相为100%甲醇与0.05%磷酸；柱温28 ℃。
1.2.3 标准曲线的建立。