【摘 要】
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目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(Glucan-binding protein C gene,gbpC)编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达.方法:根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸
【机 构】
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第四军医大学口腔医学院牙体牙髓病科,第四军医大学口腔医学院检验科,第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室
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目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(Glucan-binding protein C gene,gbpC)编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达.方法:根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342 bp～1794 bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定.将克隆获得的约0.45 kb的gbpC基因特异片段经EcoRI/SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物.结果:测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合.结论:成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,为制备GbpC抗体打下了基础.
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