论文部分内容阅读
【摘 要】目的：优选用于膝骨关节炎的膝骨痹康袋泡熏洗剂的提取工艺。方法：采用L9（34）的正交试验法，利用高效液相色谱法和紫外分光光度法分别测定柚皮苷和乌头碱的含量，并以干膏得率、柚皮苷含量和乌头碱含量的加权综合评分作为工艺筛选的评价指标，考察膝骨痹康袋泡熏洗剂制剂的水提取加水量、煎煮时间和提取次数对提取工艺的影响，确定膝骨痹康袋泡熏洗剂的最优提取工艺。结果：膝骨痹康袋泡熏洗剂最优提取工艺为15倍加水量，煎煮3次，每次1 h，验证3批所得样品平均的干膏得率、柚皮苷含量和乌头碱含量分别为20.73%、102.5 mg、22.4 mg，与正交试验结果相符，达到优化效果。结论：优选的提取工艺简便、稳定、重复性好，可用于膝骨痹康袋泡熏洗剂的工业化生产，为该制剂的进一步研究奠定良好的基础。
【关键词】 骨关节炎，膝；袋泡熏洗剂；提取工艺；正交优化
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.08.007
【ABSTRACT】Objective：To optimize the extraction process of Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing.Methods：L9（34） orthogonal test method，high performance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry were used to determine the contents of naringin and aconitine，and the rate of dry extract and the weighted scores of the contents of naringin and aconitine were used as evaluation index for screening process in order to study the effect of amount of water，decoction time and times of extraction on extraction technology and to optimize the extraction process of Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing.Results：The optimal extraction process of Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing was to add 15 times of water and decoct for3 times，1 h each time.It was verified that the average rate of dry extract and the contents of naringin and aconitine of the 3 batches of samples were respectively 20.73%，102.5 mg and 22.4 mg，which was consistent to the orthogonal test result.Conclusion：The optimized extraction process is simple，stable and reproducible and can be used for the industrial production.It is a good foundation for further research.
【Keywords】osteoarthritis，knee；Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing；extraction process；orthogonal optimization
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）属中医学“膝骨痹”范畴，是一种以关节软骨退变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，多见于中老年人，女性多于男性。KOA的发生发展是一种长期、慢性、渐进的病理过程，对早、中期患者治疗在于控制关节疼痛、延缓或阻断残疾进展、恢复关节活动功能[1-3]。
作为传统中药外治法之一的熏洗法，具有理疗和中药的双重治疗作用，同时通过经皮给药可以避免肝脏的首关效应及胃肠道影响，医患均易于控制给药并维持稳定而持久的药物浓度，在治疗KOA方面取得良好的效果[4-6]。但熏洗过程中需要患者自行煎煮药汤，较为费时、繁琐，极大地降低了患者依从性。膝骨痹康袋泡熏洗剂由骨碎补、制川乌、艾绒、红花等药材组成，具有祛风湿、止痹痛、通经络、强筋骨之功效，是临床外用熏洗治疗KOA的经验方，适用于肝肾气血虚损、风寒湿瘀痹阻为基本病机的KOA患者，对缓解疼痛、肿胀、关节功能障碍等疗效确切。
本研究拟将其改为袋泡熏洗剂，以君药骨碎补中的药效成分柚皮苷以及臣药川乌中的乌头碱为指标，通过L9（34）正交试验，开展袋泡熏洗剂提取工艺的优化试验，为该制剂的新药研制奠定基础。
1 试验材料
1.1 试验仪器 双光束紫外可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司）；数显恒温水浴锅（HH-6，国华电器有限公司）；高效液相色谱仪（LC-20A，SPD-M20A PDA检测器，LC-20AT四元梯度泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司）；色谱柱（Diamonsil C18 5 u 250 mm×4.6 mm）；万分之一电子分析天平（FA604A，上海精天电子仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-400E，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240，上海精宏试验设备有限公司）。 1.2 试验药材 研究所需药材购于福建百晟药业有限公司。槲寄生（产地河北，批号1406005）；骨碎补（产地江西，批号1408005）；续断（产地湖北，批号1407007）；伸筋草（产地江西，批号1405005）；透骨草（产地湖南，批号1404004）；海桐皮（产地贵州，批号1403003）；艾绒（产地安徽，批号20140506）；制川乌（产地四川，批号131101）；制草乌（产地山西，批号131015）；白芷（产地安徽，批号20140618）；威灵仙（产地辽宁，批号1404004）；川芎（产地四川，批号20140408）；川椒（产地四川，批号140301）；红花（产地新疆，批号20140418）。
1.3 试验试剂 研究所需乌头碱对照品（0720-9807）购于中国食品药品检定研究院，柚皮苷对照品（110722-201312）购于中国药品生物制品检定研究院。甲醇为色谱纯，三氯甲烷、冰醋酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计 前期预试验以水为溶媒，对复方药材进行水提，并以柚皮苷及干浸膏得率的综合评分为指标，发现加水量、煎煮时间、煎煮次数对结果有明显影响。根据预试验并参考文献[7]，本研究对加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）进行正交试验考查，各因素拟定3个水平，见表1。以加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素为考察对象，以干浸膏得率、柚皮苷含量、乌头碱含量的综合评分作为确定最佳提取工艺的衡量指标，选用L9（34）正交试验表进行试验，见表2。其中D列为自动生成的误差列，筛选最佳的提取工艺。柚皮苷（Ⅰ）和乌头碱（Ⅱ）为复方中代表性的有效成分，选择其作为评价指标之一，权重系数各定为0.4，而作为有效成分煎出间接控制的一个指标，药效物质提取的多少可以从干膏得率（Ⅲ）的大小来判断，权重系数定为0.2，进行综合评价，筛选最佳工艺。准确称取除红花外的复方药材9份，每份158 g，按L9（34）正交试验所示条件提取，滤过，合并提取液，将其水浴蒸发浓缩，烘箱减压干燥，得干浸膏作为各供试样品备用。综合评分=（Ⅰ/Ⅰmax×0.4 + Ⅱ/Ⅱmax×0.4 + Ⅲ/Ⅲmax×0.2）×100。
2.2 指标测定
2.2.1 干浸膏得率的测定 提取液浓缩后置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置烘箱中减压干燥至恒重，称重。计算干浸膏得率，干浸膏得率（%）=干膏量/药材总量×100%。结果见表2，方差分析见表3。
2.2.2 柚皮苷含量测定
2.2.2.1 对照品溶液的制备 柚皮苷对照品精密称定2.01 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度得对照品溶液，其质量分数为201 μg·mL-1。
2.2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取1.6 g各提取方法所得的干浸膏，至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，密塞，超声10 min，静置10 min，并用甲醇定容至刻度。取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得续滤液作为供试品溶液备用。按处方比例及工艺制备不含骨碎补的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。
2.2.2.3 色谱条件 色谱柱Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相乙腈∶质量分数为0.4%的醋酸水= 19∶81；检测波长为283 nm；流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃；进样量为10 μL。
2.2.2.4 专属性考察 分别取2.2.2.1项下对照品溶液、2.2.2.2项下供试品液、阴性样品溶液，按上述HPLC分析条件测定，进样10 μL，结果表明，阴性样品溶液在柚皮苷峰位处无干扰，证明此法具有良好的专属性，见图1。
2.2.2.5 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，质量分数分别为20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg·mL-1，按2.2.2.3项下条件进行测定，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，药物质量分数（C）为横坐标，进行线性回归，得柚皮苷回归方程为Y = 18 722 C-33 165（r = 0.999 9），结果表明，柚皮苷质量分数在20.1～100.5 μg·mL-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.2.2.6 精密度试验 精密称取60.3 μg·mL-1柚皮苷对照品溶液，重复进样6次，测得峰面积，计算柚皮苷含量，结果RSD为0.99%，表明仪器精密度良好。
2.2.2.7 重复性试验 取供试品溶液6份，分别进样，测定柚皮苷峰面积，并计算其RSD值。结果RSD为1.59%，说明该方法的重复性好。
2.2.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样测定柚皮苷峰面积，并计算其RSD值。结果RSD为1.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.2.9 加样回收率试验 取已知柚皮苷含量供试品溶液6份，分别加入同质量的柚皮苷对照品，按供试品溶液制备方法制备样品，按上述色谱条件进样分析，记录峰面积，结果表明，柚皮苷平均加样回收率为107.4%，RSD为1.26%。
2.2.3 乌头碱含量测定
2.2.3.1 对照品溶液的配制 精密称定乌头碱对照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解乌头碱对照品，并定容至刻度，摇匀，即得100 μg·mL-1乌头碱对照品溶液。
2.2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取8.05 g生药量的9种正交试验方法所得的干浸膏量样分别为0.95，1.35，1.65，1.1，1.35，1.0，1.2，0.8，1.25 g，加质量分数为10%的氨试液使湿润，静置5 min，加三氯甲烷8 mL，涡旋5 min，3000 r·min-1的离心速度离心10 min，取下层，即得供试品溶液，紫外分光光度计在200～600 nm波长范围内扫描，结果在241 nm处有最大吸收。 2.2.3.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5，1，2，4，6 mL于10 mL的容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，质量分数分别为5，10，20，40，60 μg·mL-1。于241 nm波长处测定吸光度，以三氯甲烷作为空白。以吸光度A值为纵坐标，对照品溶液质量分数C为横坐标，得乌头碱的线性方程为A = 0.008 1 C + 0.062 7（r = 0.998 1），结果表明乌头碱质量分数在5～60 μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3 正交试验提取优选结果 按照2.2.2与2.2.3项下的方法分别测定由正交试验设计的9种提取方法而得的柚皮苷和乌头碱的含量，结果见表2。由表2可知，各因素影响提取效果的因素顺序为C > A > B。表3与表4的方差分析结果表明，C对干浸膏得率的影响，差异有统计学意义（P < 0.05）。但3种因素对综合评分的影响比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结合工业化生产的实际情况，确定从柚皮苷含量、乌头碱含量及干浸膏得率的综合评分优选出提取工艺为A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。
3 验证试验
为了验证上述结论的准确性，按照最佳工艺条件A2B2C3进行3次试验，结果干浸膏得率、乌头碱、柚皮苷含量平均值分别为20.73%、22.4 mg、102.5 mg，验证结果与正交试验结果基本一致，证明该工艺稳定可行。
4 讨 论
本试验通过水提方法，经正交试验优选，得最优提取工艺为A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。提取工艺简便、廉价，且工艺验证试验显示，该工艺稳定，可行性高。在柚皮苷含量测定时，预试验通过参考相关文献尝试改变流动相比例[8]，如流动相乙腈与质量分数为0.4%的醋酸水比例为20∶80和18∶82，发现样品分离度和峰形较差，而调整流动相乙腈与质量分数为0.4%的醋酸水比例为19∶81，对照品和样品得以较好分离，符合含量测定要求。这表明针对具体的检测指标，对于常规的检测方案有时进行细微的调整是必要的。
中药的提取工艺对保持中药复方的疗效具有直接影响，同时中药的提取工艺路线应与所选择的剂型相关，适宜的提取工艺是中药剂型改进和创新的前提和基础。为了发挥中药复方整体效应与综合作用，使复方中多种成分同时提取，需要选择一种可让多种有效成分最大溶出的溶媒。本研究根据膝骨痹康袋泡熏洗剂的临床用法特点及复方中中药有效成分的特点，同时根据制剂工艺的可行性、经济性且易于产业化的考虑，对复方中除红花以外的其他中药进行共煎水提。
合理选择评价指标，筛选出最佳工艺条件，是中药制造现代化研究的重要领域[9]。中药袋泡熏洗剂指中药材经过一定的工艺制备后，装入以纤维滤纸为包袋材料的袋中，再放于开水或热水中浸泡使用的一种制剂。膝骨痹康袋泡熏洗剂共有14味中药，共奏祛风湿、止痹痛、通经络、强筋骨之功效。然而其中有效成分复杂，作用机制不明确，根据文献[10-13]复习及组方药物特点，结合KOA肝肾气血虚损、风寒湿瘀痹阻的基本病机特点，本试验选取了该方中补肝肾、壮筋骨的君药骨碎补及祛寒湿、止痹痛的臣药制川乌的主要成分作为观察指标。骨碎补始载于《本草拾遗》，现代研究表明，骨碎补能增强成骨细胞活性、提高骨密度、维持骨微结构的完整程度，是肾主骨生髓的物质基础之一[14]。骨碎补浸膏以水为溶剂时提取效果较好[15]，柚皮苷为一种双二氢黄酮类化合物，其化学性质稳定，具有较好的耐热性，是骨碎补的主要活性物质之一，有益于骨关节伤病的愈合[16]；乌头碱为制川乌的主要成分，故笔者选择乌头碱与柚皮苷的含量及复方浸膏得率的加权综合评分作为膝骨痹康袋泡熏洗剂的提取评价指标，这种评价相对较客观可靠。
5 参考文献
[1] 蔡建华，李建强，邝锦波.白金膏治疗膝骨关节炎的临床疗效[J].广东医学，2014，35（7）：1108-1110.
[2] 寇俊梓，李钊.中药熏洗方治疗膝关节骨性关节炎的临床研究[J].光明中医，2014，29（4）：751-752.
[3] 汪利合，李慧英，赵鹏飞，等.消瘀定痛散外敷治疗中重度膝骨关节炎36例[J].风湿病与关节炎，2013，2（12）：17-18.
[4] 陈海鹏，刘志坤.膝痛消熏洗方治疗膝骨关节炎临床疗效评价[J].风湿病与关节炎，2013，2（4）：29-31.
[5] 苗明三，郭艳，尹俊涛.中药外用研究的思路[J].时珍国医国药，2009，20（10）：2574-2575.
[6] 许梅馨.海桐皮汤熏洗治疗早、中期膝关节骨性关节炎98例[J].浙江中西医结合杂志，2012，22（1）：34-35.
[7] 陈丰连，贾薇，曾元儿.影响骨碎补浸膏中柚皮苷含量的因素研究[J].中药新药与临床药理，2005，16（3）：210-211.
[8] 李遇伯，孟繁浩，潘晓峰，等.HPLC同时测定骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量[J].药物分析杂志，2006，26（6）：808-810.
[9] 黄永亮，吴纯洁，何晓燕.中药提取工艺评价指标的研究进展[J].中药与临床，2012，3（5）：49-52.
[10] 景晶，曹红.高效液相色谱法测定舒筋止痛酊中柚皮苷的含量[J].解放军药学学报，2010，26（1）：63-65.
[11] 区炳雄，邓广海，罗锐.川乌总生物碱含量测定[J].中药材，2013，36（6）：946-947.
[12] 全维明，李博.高效液相色谱法测定骨质增生散中柚皮苷的含量[J].时珍国医国药，2013，24（8）：1892-1893.
[13] 钟国跃，于超，赵志礼.中药质量评价方法新探——“有限成分组合质量标准”论[J].中国中药杂志，2002，27（9）：719-720.
[14] 赵刚，蔡定芳，董淑范，等.不同补肾法对骨质疏松症模型大鼠作用的比较研究[J].上海中医药杂志，2002，36（7）：44-47.
[15] 王允，刘毅，姚干.骨碎补提取与含量测定研究概况[J].中国药业，2007，16（6）：63.
[16] 唐琪，陈莉丽，严杰.骨碎补提取物促小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、分化和钙化作用的研究[J].中国中药杂志，2004，29（2）：164-168.
收稿日期：2015-03-12；修回日期：2015-05-31
【关键词】 骨关节炎，膝；袋泡熏洗剂；提取工艺；正交优化
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.08.007
【ABSTRACT】Objective：To optimize the extraction process of Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing.Methods：L9（34） orthogonal test method，high performance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry were used to determine the contents of naringin and aconitine，and the rate of dry extract and the weighted scores of the contents of naringin and aconitine were used as evaluation index for screening process in order to study the effect of amount of water，decoction time and times of extraction on extraction technology and to optimize the extraction process of Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing.Results：The optimal extraction process of Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing was to add 15 times of water and decoct for3 times，1 h each time.It was verified that the average rate of dry extract and the contents of naringin and aconitine of the 3 batches of samples were respectively 20.73%，102.5 mg and 22.4 mg，which was consistent to the orthogonal test result.Conclusion：The optimized extraction process is simple，stable and reproducible and can be used for the industrial production.It is a good foundation for further research.
【Keywords】osteoarthritis，knee；Bagged Xigubikang for Fumigating and Washing；extraction process；orthogonal optimization
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）属中医学“膝骨痹”范畴，是一种以关节软骨退变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，多见于中老年人，女性多于男性。KOA的发生发展是一种长期、慢性、渐进的病理过程，对早、中期患者治疗在于控制关节疼痛、延缓或阻断残疾进展、恢复关节活动功能[1-3]。
作为传统中药外治法之一的熏洗法，具有理疗和中药的双重治疗作用，同时通过经皮给药可以避免肝脏的首关效应及胃肠道影响，医患均易于控制给药并维持稳定而持久的药物浓度，在治疗KOA方面取得良好的效果[4-6]。但熏洗过程中需要患者自行煎煮药汤，较为费时、繁琐，极大地降低了患者依从性。膝骨痹康袋泡熏洗剂由骨碎补、制川乌、艾绒、红花等药材组成，具有祛风湿、止痹痛、通经络、强筋骨之功效，是临床外用熏洗治疗KOA的经验方，适用于肝肾气血虚损、风寒湿瘀痹阻为基本病机的KOA患者，对缓解疼痛、肿胀、关节功能障碍等疗效确切。
本研究拟将其改为袋泡熏洗剂，以君药骨碎补中的药效成分柚皮苷以及臣药川乌中的乌头碱为指标，通过L9（34）正交试验，开展袋泡熏洗剂提取工艺的优化试验，为该制剂的新药研制奠定基础。
1 试验材料
1.1 试验仪器 双光束紫外可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司）；数显恒温水浴锅（HH-6，国华电器有限公司）；高效液相色谱仪（LC-20A，SPD-M20A PDA检测器，LC-20AT四元梯度泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司）；色谱柱（Diamonsil C18 5 u 250 mm×4.6 mm）；万分之一电子分析天平（FA604A，上海精天电子仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-400E，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240，上海精宏试验设备有限公司）。 1.2 试验药材 研究所需药材购于福建百晟药业有限公司。槲寄生（产地河北，批号1406005）；骨碎补（产地江西，批号1408005）；续断（产地湖北，批号1407007）；伸筋草（产地江西，批号1405005）；透骨草（产地湖南，批号1404004）；海桐皮（产地贵州，批号1403003）；艾绒（产地安徽，批号20140506）；制川乌（产地四川，批号131101）；制草乌（产地山西，批号131015）；白芷（产地安徽，批号20140618）；威灵仙（产地辽宁，批号1404004）；川芎（产地四川，批号20140408）；川椒（产地四川，批号140301）；红花（产地新疆，批号20140418）。
1.3 试验试剂 研究所需乌头碱对照品（0720-9807）购于中国食品药品检定研究院，柚皮苷对照品（110722-201312）购于中国药品生物制品检定研究院。甲醇为色谱纯，三氯甲烷、冰醋酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计 前期预试验以水为溶媒，对复方药材进行水提，并以柚皮苷及干浸膏得率的综合评分为指标，发现加水量、煎煮时间、煎煮次数对结果有明显影响。根据预试验并参考文献[7]，本研究对加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）进行正交试验考查，各因素拟定3个水平，见表1。以加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素为考察对象，以干浸膏得率、柚皮苷含量、乌头碱含量的综合评分作为确定最佳提取工艺的衡量指标，选用L9（34）正交试验表进行试验，见表2。其中D列为自动生成的误差列，筛选最佳的提取工艺。柚皮苷（Ⅰ）和乌头碱（Ⅱ）为复方中代表性的有效成分，选择其作为评价指标之一，权重系数各定为0.4，而作为有效成分煎出间接控制的一个指标，药效物质提取的多少可以从干膏得率（Ⅲ）的大小来判断，权重系数定为0.2，进行综合评价，筛选最佳工艺。准确称取除红花外的复方药材9份，每份158 g，按L9（34）正交试验所示条件提取，滤过，合并提取液，将其水浴蒸发浓缩，烘箱减压干燥，得干浸膏作为各供试样品备用。综合评分=（Ⅰ/Ⅰmax×0.4 + Ⅱ/Ⅱmax×0.4 + Ⅲ/Ⅲmax×0.2）×100。
2.2 指标测定
2.2.1 干浸膏得率的测定 提取液浓缩后置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置烘箱中减压干燥至恒重，称重。计算干浸膏得率，干浸膏得率（%）=干膏量/药材总量×100%。结果见表2，方差分析见表3。
2.2.2 柚皮苷含量测定
2.2.2.1 对照品溶液的制备 柚皮苷对照品精密称定2.01 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度得对照品溶液，其质量分数为201 μg·mL-1。
2.2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取1.6 g各提取方法所得的干浸膏，至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，密塞，超声10 min，静置10 min，并用甲醇定容至刻度。取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得续滤液作为供试品溶液备用。按处方比例及工艺制备不含骨碎补的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。
2.2.2.3 色谱条件 色谱柱Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相乙腈∶质量分数为0.4%的醋酸水= 19∶81；检测波长为283 nm；流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃；进样量为10 μL。
2.2.2.4 专属性考察 分别取2.2.2.1项下对照品溶液、2.2.2.2项下供试品液、阴性样品溶液，按上述HPLC分析条件测定，进样10 μL，结果表明，阴性样品溶液在柚皮苷峰位处无干扰，证明此法具有良好的专属性，见图1。
2.2.2.5 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，质量分数分别为20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg·mL-1，按2.2.2.3项下条件进行测定，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，药物质量分数（C）为横坐标，进行线性回归，得柚皮苷回归方程为Y = 18 722 C-33 165（r = 0.999 9），结果表明，柚皮苷质量分数在20.1～100.5 μg·mL-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.2.2.6 精密度试验 精密称取60.3 μg·mL-1柚皮苷对照品溶液，重复进样6次，测得峰面积，计算柚皮苷含量，结果RSD为0.99%，表明仪器精密度良好。
2.2.2.7 重复性试验 取供试品溶液6份，分别进样，测定柚皮苷峰面积，并计算其RSD值。结果RSD为1.59%，说明该方法的重复性好。
2.2.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样测定柚皮苷峰面积，并计算其RSD值。结果RSD为1.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.2.9 加样回收率试验 取已知柚皮苷含量供试品溶液6份，分别加入同质量的柚皮苷对照品，按供试品溶液制备方法制备样品，按上述色谱条件进样分析，记录峰面积，结果表明，柚皮苷平均加样回收率为107.4%，RSD为1.26%。
2.2.3 乌头碱含量测定
2.2.3.1 对照品溶液的配制 精密称定乌头碱对照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解乌头碱对照品，并定容至刻度，摇匀，即得100 μg·mL-1乌头碱对照品溶液。
2.2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取8.05 g生药量的9种正交试验方法所得的干浸膏量样分别为0.95，1.35，1.65，1.1，1.35，1.0，1.2，0.8，1.25 g，加质量分数为10%的氨试液使湿润，静置5 min，加三氯甲烷8 mL，涡旋5 min，3000 r·min-1的离心速度离心10 min，取下层，即得供试品溶液，紫外分光光度计在200～600 nm波长范围内扫描，结果在241 nm处有最大吸收。 2.2.3.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5，1，2，4，6 mL于10 mL的容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，质量分数分别为5，10，20，40，60 μg·mL-1。于241 nm波长处测定吸光度，以三氯甲烷作为空白。以吸光度A值为纵坐标，对照品溶液质量分数C为横坐标，得乌头碱的线性方程为A = 0.008 1 C + 0.062 7（r = 0.998 1），结果表明乌头碱质量分数在5～60 μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3 正交试验提取优选结果 按照2.2.2与2.2.3项下的方法分别测定由正交试验设计的9种提取方法而得的柚皮苷和乌头碱的含量，结果见表2。由表2可知，各因素影响提取效果的因素顺序为C > A > B。表3与表4的方差分析结果表明，C对干浸膏得率的影响，差异有统计学意义（P < 0.05）。但3种因素对综合评分的影响比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结合工业化生产的实际情况，确定从柚皮苷含量、乌头碱含量及干浸膏得率的综合评分优选出提取工艺为A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。
3 验证试验
为了验证上述结论的准确性，按照最佳工艺条件A2B2C3进行3次试验，结果干浸膏得率、乌头碱、柚皮苷含量平均值分别为20.73%、22.4 mg、102.5 mg，验证结果与正交试验结果基本一致，证明该工艺稳定可行。
4 讨 论
本试验通过水提方法，经正交试验优选，得最优提取工艺为A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。提取工艺简便、廉价，且工艺验证试验显示，该工艺稳定，可行性高。在柚皮苷含量测定时，预试验通过参考相关文献尝试改变流动相比例[8]，如流动相乙腈与质量分数为0.4%的醋酸水比例为20∶80和18∶82，发现样品分离度和峰形较差，而调整流动相乙腈与质量分数为0.4%的醋酸水比例为19∶81，对照品和样品得以较好分离，符合含量测定要求。这表明针对具体的检测指标，对于常规的检测方案有时进行细微的调整是必要的。
中药的提取工艺对保持中药复方的疗效具有直接影响，同时中药的提取工艺路线应与所选择的剂型相关，适宜的提取工艺是中药剂型改进和创新的前提和基础。为了发挥中药复方整体效应与综合作用，使复方中多种成分同时提取，需要选择一种可让多种有效成分最大溶出的溶媒。本研究根据膝骨痹康袋泡熏洗剂的临床用法特点及复方中中药有效成分的特点，同时根据制剂工艺的可行性、经济性且易于产业化的考虑，对复方中除红花以外的其他中药进行共煎水提。
合理选择评价指标，筛选出最佳工艺条件，是中药制造现代化研究的重要领域[9]。中药袋泡熏洗剂指中药材经过一定的工艺制备后，装入以纤维滤纸为包袋材料的袋中，再放于开水或热水中浸泡使用的一种制剂。膝骨痹康袋泡熏洗剂共有14味中药，共奏祛风湿、止痹痛、通经络、强筋骨之功效。然而其中有效成分复杂，作用机制不明确，根据文献[10-13]复习及组方药物特点，结合KOA肝肾气血虚损、风寒湿瘀痹阻的基本病机特点，本试验选取了该方中补肝肾、壮筋骨的君药骨碎补及祛寒湿、止痹痛的臣药制川乌的主要成分作为观察指标。骨碎补始载于《本草拾遗》，现代研究表明，骨碎补能增强成骨细胞活性、提高骨密度、维持骨微结构的完整程度，是肾主骨生髓的物质基础之一[14]。骨碎补浸膏以水为溶剂时提取效果较好[15]，柚皮苷为一种双二氢黄酮类化合物，其化学性质稳定，具有较好的耐热性，是骨碎补的主要活性物质之一，有益于骨关节伤病的愈合[16]；乌头碱为制川乌的主要成分，故笔者选择乌头碱与柚皮苷的含量及复方浸膏得率的加权综合评分作为膝骨痹康袋泡熏洗剂的提取评价指标，这种评价相对较客观可靠。
5 参考文献
[1] 蔡建华，李建强，邝锦波.白金膏治疗膝骨关节炎的临床疗效[J].广东医学，2014，35（7）：1108-1110.
[2] 寇俊梓，李钊.中药熏洗方治疗膝关节骨性关节炎的临床研究[J].光明中医，2014，29（4）：751-752.
[3] 汪利合，李慧英，赵鹏飞，等.消瘀定痛散外敷治疗中重度膝骨关节炎36例[J].风湿病与关节炎，2013，2（12）：17-18.
[4] 陈海鹏，刘志坤.膝痛消熏洗方治疗膝骨关节炎临床疗效评价[J].风湿病与关节炎，2013，2（4）：29-31.
[5] 苗明三，郭艳，尹俊涛.中药外用研究的思路[J].时珍国医国药，2009，20（10）：2574-2575.
[6] 许梅馨.海桐皮汤熏洗治疗早、中期膝关节骨性关节炎98例[J].浙江中西医结合杂志，2012，22（1）：34-35.
[7] 陈丰连，贾薇，曾元儿.影响骨碎补浸膏中柚皮苷含量的因素研究[J].中药新药与临床药理，2005，16（3）：210-211.
[8] 李遇伯，孟繁浩，潘晓峰，等.HPLC同时测定骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量[J].药物分析杂志，2006，26（6）：808-810.
[9] 黄永亮，吴纯洁，何晓燕.中药提取工艺评价指标的研究进展[J].中药与临床，2012，3（5）：49-52.
[10] 景晶，曹红.高效液相色谱法测定舒筋止痛酊中柚皮苷的含量[J].解放军药学学报，2010，26（1）：63-65.
[11] 区炳雄，邓广海，罗锐.川乌总生物碱含量测定[J].中药材，2013，36（6）：946-947.
[12] 全维明，李博.高效液相色谱法测定骨质增生散中柚皮苷的含量[J].时珍国医国药，2013，24（8）：1892-1893.
[13] 钟国跃，于超，赵志礼.中药质量评价方法新探——“有限成分组合质量标准”论[J].中国中药杂志，2002，27（9）：719-720.
[14] 赵刚，蔡定芳，董淑范，等.不同补肾法对骨质疏松症模型大鼠作用的比较研究[J].上海中医药杂志，2002，36（7）：44-47.
[15] 王允，刘毅，姚干.骨碎补提取与含量测定研究概况[J].中国药业，2007，16（6）：63.
[16] 唐琪，陈莉丽，严杰.骨碎补提取物促小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、分化和钙化作用的研究[J].中国中药杂志，2004，29（2）：164-168.
收稿日期：2015-03-12；修回日期：2015-05-31