【摘 要】
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目的观察腺相关病毒（AAV）介导小发夹RNA（shRNA）干扰抑制Claudin-3表达对体外培养小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的影响。方法原代培养小鼠RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组。细胞接种24 h后，AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC分别转染AAV-shScramble和AAV-shClaudin3。转染9
【机 构】
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中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室, 广州,510060;
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目的 观察腺相关病毒(AAV)介导小发夹RNA(shRNA)干扰抑制Claudin-3表达对体外培养小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的影响.方法 原代培养小鼠RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组.细胞接种24 h后,AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC分别转染AAV-shScramble和AAV-shClaudin3.转染96h后,活细胞荧光动态显微镜观察目的病毒转染效率;β-微管蛋白免疫荧光染色检测RGC轴突长度;免疫荧光4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察RGC凋亡形态;实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组RGC Claudin-3、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达;蛋白免疫印迹法(West blot)检测各组RGC Claudin-3、VEGF、B淋巴细胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平.结果 活细胞动态荧光显微镜观察发现,AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC病毒转染效率均＞50％;病毒转染96 h后,AAV-shClaudin3组RGC轴突长度明显低于正常对照组、AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=2 363.274,P＜0.05);AAV-shClaudin3组RGC密度较正常对照组、AAV-shScramble组明显减低,可见细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的凋亡小体.AAV-shClaudin组RGC的Claudin-3、VEGF mRNA表达明显低于正常对照组和AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=257.408、160.533,P＜0.05).AAV-shClaudin3组RGC的Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显低于正常对照组和AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=129.671、420.552、62.669,P＜0.05);Caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组、AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=231.348,P＜0.05).结论 AAV介导shRNA干扰抑制Claudin-3的表达可下调VEGF、Bcl-2及上调Caspase-3的表达,促进RGC凋亡,抑制RGC轴突生长.
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