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摘要 [目的]获得外源表达的可溶性水稻VDAC3蛋白。[方法]将osvdac3基因克隆到含有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中，转化入BL21表达菌株，经IPTG诱导，并使用SDSPAGE和Western Blot检测分析表达产物，通过Glutathione Resin 亲和层析系统纯化获得较纯的目的蛋白。[结果]试验成功构建了pGEX4T1osvdac3原核表达载体并转化大肠杆菌。通过SDSPAGE和Western Blot试验证实56 kD处的蛋白条带是具有可溶性表达的VDAC3蛋白。[结论]经Glutathione Resin亲和层析系统纯化得到可溶性带GST标签的VDAC3蛋白。该研究结果为水稻VDAC蛋白的功能研究进一步奠定了基础。
关键词 原核表达；GST标签；亲和纯化
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03815-04
Abstract [Objective] To achieve activated OsVDAC3 protein in vitro.[Method] The recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 with the GSTtag was constructed and transformed into E.coli.TheGsttagged OsVDAC3 protein was induced with IPTG in E.coli strain BL21， and confirmed by SDSPAGE and WesternBlot analysis.In addition， the GSTtagged recombinant OsVDAC3 protein was purified by Glutathione resin.[Result] The results showed that the recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 was constructed and transformed into E.coli successfully.The results of SDSPAGE and Western Blot showed a band in the 56 kD and indicated the GSTtag OSVDAC3 protein was partly existed in the soluble composition.[Conclusion] The GSTtag OsVDAC3 protein was isolated and purified by using Glutathione Resin.The research laid a foundation for the further study of the function of VDAC in the rice.
Key words Prokaryotic expression； GST tag； Affinity purification
电压依赖性阴离子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）是线粒体外膜高度的保守的，最丰富的蛋白，在所有的真核生物中都存在。在调节代谢物在线粒体与细胞质之间的运输具有重要的作用[1-2]。在植物中，烟草中至少有3种亚型，拟南芥和百脉根中发现有5种不同的亚型。较酵母与哺乳动物，植物中有更多的VDAC异构形式，暗示植物VDAC具有多种不同的功能[3-6]。实验室前期工作证明，水稻基因组中存在8个vdac基因，不同vdac基因在水稻不同组织和生殖发育时期的表达不同，同时vdac基因的表达受各种生物和非生物的胁迫的影响，如盐胁迫和热胁迫等[7-8]。这些结论都表明，不同的VDAC蛋白对水稻生长发育具有重要作用。罗凤燕等通过Real-time PCR比较分析了8个vdac基因在红莲型水稻不育系YTA不同发育时期的表达模式，发现osvdac3在水稻生殖生长期达到较高表达水平，显示其可能参与水稻的生殖发育相关过程[8]。江晨等利用Gateway重组克隆技术对水稻YTB中的osvdac3基因进行基因干涉，发现转基因植株结实率明显低于野生型YTB[9]。
在原核细胞表达外源基因过程中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包涵体（ inclusion body）。以包涵体形式存在的蛋白质分子不具有正确的天然三维结构， 表达蛋白不具有生物活性[10-11]，为后续的研究提供了诸多的不便。VDAC蛋白作为跨膜蛋白，在原核表达时大多以包涵体的形式存在。虽然可以通过蛋白变性等方法可以获得可溶性蛋白，但这样得到的可溶性蛋白常常会带来蛋白结构上的改变，不利于后期的进一步功能研究[12]。因此，试验以前期得到的与水稻生殖发育相关的osvdac3基因为对象，构建pGEX4T1osvdac3原核表达载体并尝试不同的IPTG诱导条件，纯化得到可溶性GSTOsVDAC3融合蛋白，以期为下一步获取与OsVDAC3蛋白相互作用的水稻蛋白及研究该蛋白在水稻生长发育的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）和原核表达载体pGEX-4T-1，均由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。
1.1.2 主要仪器。752N紫外可见分光光度计，购自上海精科公司；Gene Genius系统，购自SYNOPTICS LTD（英国）；凝胶成像系统，购自美国Bio-RAD公司；C1000 touch thermal cyclerPCR仪，购自美国Bio-RAD公司；centrifuge 5415D、5417R和5810R离心机，购自德国eppendorf公司；CR22G高速离心机，购自日本Hitachi公司；FB-SDB-2020半干式转印槽，购自美国Fisher Scientific公司；Model 1000分子杂交箱，购自美国Robbins Scientific Corporation；Soniprep 150超声破碎仪，购自日本SANYO公司；DYY-5型稳压稳流电泳仪，购自北京六一仪器厂。 1.1.3 主要试剂。限制性内切酶BamHI、XholI，PCR 扩增反应rTaq酶，蛋白分子量Marker和DNA分子量Marker，T4 DNA连接酶，皆购自于Takara公司；PagerulerPrestained蛋白分子量Marker，购自FERMENTAS公司。DNA凝胶回收及清洁试剂盒，购自Axygen公司；GST抗体及二抗，均购自南京金斯瑞生物技术有限公司；引物及测序均有南京金斯瑞生物有限公司进行。
1.2 方法
3 结论与讨论
关于VDAC，以前人们更多的是集中在动物中VDAC功能的研究。随着研究的深入，越来越多的人开始关注植物中的VDAC，并发现植物的VDAC蛋白在植物的生长与发育起到了十分重要的作用。Liu等发现在拟南芥中，VDAC3与AtKP1相互作用能够调节种子在低温萌发是的呼吸作用，Himmelbach， Yang等发现，VDAC与AtGluRS相互作用在ABA的信号转导途径中起到了重要的调节作用[13]。因此针对VDAC相互作用蛋白的研究对明确VDAC蛋白的功能是有非常重要的。同时，体外pulldown试验通常需要可溶性的VDAC蛋白，但在VDAC蛋白的的研究中，外源表达VDAC蛋白时常会形成包涵体，因此需要通过复性操作以得到具有预期生物活性的蛋白质。而通常的包涵体复性过程中，复性条件难以控制，成本高，在复性过程中也很难保证包涵体蛋白形成正确的折叠结构。而如果能从上清较少的表达量中纯化出可溶性的VDAC蛋白，则会避免这个问题。
实验室前期采用pET30a（+）原核表达载体，构建了带有组氨酸标签的OsVDAC3融合蛋白的原核表达载体[14]。但是带有组氨酸标签的OsVDAC3融合蛋白几乎都以包涵体的形式存在，几乎不能纯化出可溶性的带有组氨酸标签的OsVDAC3融合蛋白。因此试验采用pGEX4T1原核表达载体，其在目标蛋白的N端加上一个约26 kD的GST标签蛋白，在原核表达时得到了较pET30a（+）原核表达载体进行原核表达时更多的可溶型VDAC3蛋白，说明GST标签可能具有增进原核表达蛋白可溶型的作用；也为进一步去研究OsVDAC3蛋白在水稻中的相关功能奠定了基础。
参考文献
[1] ABRECHT H，GOORMAGHTIGH E，RUYSSCHAERT J M，et al.Structure and orientation of two voltagedependent anionselective channel isoforms[J].Journal of Biological Chemistry，2000，275（52）： 4099240999.
[2] MLAYEH L，CHATKAEW S，LONETTI M，et al.Modulation of plant mitochondrial VDAC byphytosterols[J].Biophys Journal，2010，99（7）：2097-2106.
[3] ELKELES A，DEVOS K M，GRAUR D，et al.Multiple cDNAs of wheat voltage-dependent anion channels （VDAC）：Isolation，differential expression，mapping and evolution[J].Plant Molecular Biology，1995，29： 109-124.
[4] ALBITAR F， ROOSENS N， SMEYERS M，et al.Sequence analysistranscriptional and posttranscriptional regulation of the rice vdac family，Biochim，Biophys[J].Acta， Gene Struct Expression，2003，1625：43-51.
[5] WANDREY M，TREYASKIS B，BREWIN N，et al.Molecular and cell biology of a family of voltage- dependent anion channel porins in Lotus japonicus[J].Plant Physiol，2004，134：182-193.
[6] SMACK D P，COLOMBINI M.Voltagedependent channels found in the membrane fraction of corn mitochondria[J].Plant Physiol，1985，79：1094-1097.
[7] 罗凤燕.水稻vdac、ant及HL-sp1基因的表达研究[D].武汉：中南民族大学，2010.
[8] 夏春皎.水稻线粒体渗透性转换的鉴定及其相关基因家族的系统发育分析[D].武汉：中南民族大学，2010.
[9] 江晨，程钢，刘学群，等.水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化[J].安徽农业科学，2011（28）：17176-17178.
[10] 包义风，应莲芳，蒋琳.包涵体蛋白复性技术研究进展[J].微生物学免疫学进展，2012（2）：84-88.
[11] 张婷婷，叶波平.包涵体蛋白质的复性研究进展[J].药物生物技术，2007（4）：306-309.
[12] 赵喜红，何小维，李文美，等.大肠杆菌表达包涵体蛋白体外复性研究进展[J].食品工业科技，2010（6）：379-383.
[13] TATEDA C，WATANABE K.KUSANO T，et al.Molecular and genetic characterization of the gene family encoding the voltage-dependent anion channel in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany，2011，62： 4773-4785.
[14] 秦圣光.两个osvdac基因的原核表达及其对水稻的遗传转化[D].武汉：中南民族大学，2011.
关键词 原核表达；GST标签；亲和纯化
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03815-04
Abstract [Objective] To achieve activated OsVDAC3 protein in vitro.[Method] The recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 with the GSTtag was constructed and transformed into E.coli.TheGsttagged OsVDAC3 protein was induced with IPTG in E.coli strain BL21， and confirmed by SDSPAGE and WesternBlot analysis.In addition， the GSTtagged recombinant OsVDAC3 protein was purified by Glutathione resin.[Result] The results showed that the recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T1osvdac3 was constructed and transformed into E.coli successfully.The results of SDSPAGE and Western Blot showed a band in the 56 kD and indicated the GSTtag OSVDAC3 protein was partly existed in the soluble composition.[Conclusion] The GSTtag OsVDAC3 protein was isolated and purified by using Glutathione Resin.The research laid a foundation for the further study of the function of VDAC in the rice.
Key words Prokaryotic expression； GST tag； Affinity purification
电压依赖性阴离子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）是线粒体外膜高度的保守的，最丰富的蛋白，在所有的真核生物中都存在。在调节代谢物在线粒体与细胞质之间的运输具有重要的作用[1-2]。在植物中，烟草中至少有3种亚型，拟南芥和百脉根中发现有5种不同的亚型。较酵母与哺乳动物，植物中有更多的VDAC异构形式，暗示植物VDAC具有多种不同的功能[3-6]。实验室前期工作证明，水稻基因组中存在8个vdac基因，不同vdac基因在水稻不同组织和生殖发育时期的表达不同，同时vdac基因的表达受各种生物和非生物的胁迫的影响，如盐胁迫和热胁迫等[7-8]。这些结论都表明，不同的VDAC蛋白对水稻生长发育具有重要作用。罗凤燕等通过Real-time PCR比较分析了8个vdac基因在红莲型水稻不育系YTA不同发育时期的表达模式，发现osvdac3在水稻生殖生长期达到较高表达水平，显示其可能参与水稻的生殖发育相关过程[8]。江晨等利用Gateway重组克隆技术对水稻YTB中的osvdac3基因进行基因干涉，发现转基因植株结实率明显低于野生型YTB[9]。
在原核细胞表达外源基因过程中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包涵体（ inclusion body）。以包涵体形式存在的蛋白质分子不具有正确的天然三维结构， 表达蛋白不具有生物活性[10-11]，为后续的研究提供了诸多的不便。VDAC蛋白作为跨膜蛋白，在原核表达时大多以包涵体的形式存在。虽然可以通过蛋白变性等方法可以获得可溶性蛋白，但这样得到的可溶性蛋白常常会带来蛋白结构上的改变，不利于后期的进一步功能研究[12]。因此，试验以前期得到的与水稻生殖发育相关的osvdac3基因为对象，构建pGEX4T1osvdac3原核表达载体并尝试不同的IPTG诱导条件，纯化得到可溶性GSTOsVDAC3融合蛋白，以期为下一步获取与OsVDAC3蛋白相互作用的水稻蛋白及研究该蛋白在水稻生长发育的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）和原核表达载体pGEX-4T-1，均由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。
1.1.2 主要仪器。752N紫外可见分光光度计，购自上海精科公司；Gene Genius系统，购自SYNOPTICS LTD（英国）；凝胶成像系统，购自美国Bio-RAD公司；C1000 touch thermal cyclerPCR仪，购自美国Bio-RAD公司；centrifuge 5415D、5417R和5810R离心机，购自德国eppendorf公司；CR22G高速离心机，购自日本Hitachi公司；FB-SDB-2020半干式转印槽，购自美国Fisher Scientific公司；Model 1000分子杂交箱，购自美国Robbins Scientific Corporation；Soniprep 150超声破碎仪，购自日本SANYO公司；DYY-5型稳压稳流电泳仪，购自北京六一仪器厂。 1.1.3 主要试剂。限制性内切酶BamHI、XholI，PCR 扩增反应rTaq酶，蛋白分子量Marker和DNA分子量Marker，T4 DNA连接酶，皆购自于Takara公司；PagerulerPrestained蛋白分子量Marker，购自FERMENTAS公司。DNA凝胶回收及清洁试剂盒，购自Axygen公司；GST抗体及二抗，均购自南京金斯瑞生物技术有限公司；引物及测序均有南京金斯瑞生物有限公司进行。
1.2 方法
3 结论与讨论
关于VDAC，以前人们更多的是集中在动物中VDAC功能的研究。随着研究的深入，越来越多的人开始关注植物中的VDAC，并发现植物的VDAC蛋白在植物的生长与发育起到了十分重要的作用。Liu等发现在拟南芥中，VDAC3与AtKP1相互作用能够调节种子在低温萌发是的呼吸作用，Himmelbach， Yang等发现，VDAC与AtGluRS相互作用在ABA的信号转导途径中起到了重要的调节作用[13]。因此针对VDAC相互作用蛋白的研究对明确VDAC蛋白的功能是有非常重要的。同时，体外pulldown试验通常需要可溶性的VDAC蛋白，但在VDAC蛋白的的研究中，外源表达VDAC蛋白时常会形成包涵体，因此需要通过复性操作以得到具有预期生物活性的蛋白质。而通常的包涵体复性过程中，复性条件难以控制，成本高，在复性过程中也很难保证包涵体蛋白形成正确的折叠结构。而如果能从上清较少的表达量中纯化出可溶性的VDAC蛋白，则会避免这个问题。
实验室前期采用pET30a（+）原核表达载体，构建了带有组氨酸标签的OsVDAC3融合蛋白的原核表达载体[14]。但是带有组氨酸标签的OsVDAC3融合蛋白几乎都以包涵体的形式存在，几乎不能纯化出可溶性的带有组氨酸标签的OsVDAC3融合蛋白。因此试验采用pGEX4T1原核表达载体，其在目标蛋白的N端加上一个约26 kD的GST标签蛋白，在原核表达时得到了较pET30a（+）原核表达载体进行原核表达时更多的可溶型VDAC3蛋白，说明GST标签可能具有增进原核表达蛋白可溶型的作用；也为进一步去研究OsVDAC3蛋白在水稻中的相关功能奠定了基础。
参考文献
[1] ABRECHT H，GOORMAGHTIGH E，RUYSSCHAERT J M，et al.Structure and orientation of two voltagedependent anionselective channel isoforms[J].Journal of Biological Chemistry，2000，275（52）： 4099240999.
[2] MLAYEH L，CHATKAEW S，LONETTI M，et al.Modulation of plant mitochondrial VDAC byphytosterols[J].Biophys Journal，2010，99（7）：2097-2106.
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[4] ALBITAR F， ROOSENS N， SMEYERS M，et al.Sequence analysistranscriptional and posttranscriptional regulation of the rice vdac family，Biochim，Biophys[J].Acta， Gene Struct Expression，2003，1625：43-51.
[5] WANDREY M，TREYASKIS B，BREWIN N，et al.Molecular and cell biology of a family of voltage- dependent anion channel porins in Lotus japonicus[J].Plant Physiol，2004，134：182-193.
[6] SMACK D P，COLOMBINI M.Voltagedependent channels found in the membrane fraction of corn mitochondria[J].Plant Physiol，1985，79：1094-1097.
[7] 罗凤燕.水稻vdac、ant及HL-sp1基因的表达研究[D].武汉：中南民族大学，2010.
[8] 夏春皎.水稻线粒体渗透性转换的鉴定及其相关基因家族的系统发育分析[D].武汉：中南民族大学，2010.
[9] 江晨，程钢，刘学群，等.水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化[J].安徽农业科学，2011（28）：17176-17178.
[10] 包义风，应莲芳，蒋琳.包涵体蛋白复性技术研究进展[J].微生物学免疫学进展，2012（2）：84-88.
[11] 张婷婷，叶波平.包涵体蛋白质的复性研究进展[J].药物生物技术，2007（4）：306-309.
[12] 赵喜红，何小维，李文美，等.大肠杆菌表达包涵体蛋白体外复性研究进展[J].食品工业科技，2010（6）：379-383.
[13] TATEDA C，WATANABE K.KUSANO T，et al.Molecular and genetic characterization of the gene family encoding the voltage-dependent anion channel in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany，2011，62： 4773-4785.
[14] 秦圣光.两个osvdac基因的原核表达及其对水稻的遗传转化[D].武汉：中南民族大学，2011.