【摘 要】
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目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法 采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩
【机 构】
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浙江大学医学院病原生物学系,杭州,310058
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目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法 采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段,T-A克隆后测序.构建sph2基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检查重组Sph2(rSph2)的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rSph2.采用绵羊血平板溶血试验及血红蛋白分光光度法测定rSph2的溶血活性.采用流式细胞术检测rSph2诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和肝细胞株IAR20凋亡的活性,实时荧光定量PCR检测赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞前后sph2基因mRNA水平变化.结果 与GenBank中sph2基因比较,所克隆的sph2基因序列相似性为100%.所构建的原核表达系统能高效表达rSph2.rSph2以浓度依赖方式溶解绵羊红细胞.10 μg/ml rSph2可诱导J774A.1和IAR20细胞凋亡,凋亡率峰值分别为23.96%和32.92%.赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞后0.5～2 h内sph2基因mRNA水平显著升高,2 h后mRNA水平迅速下降.结论 钩体sph2基因呈宿主细胞接触式瞬时表达.rSph2有溶解绵羊红细胞及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡的活性,因而Sph2是钩体致病过程中重要的毒力因子.
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