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[摘要]目的采用高效液相色谱法测定板蓝根水提物中（R-s）-告依春的含量，对板蓝根提取物进行质量控制。方法高效液相所用的色谱柱为phenomenex（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水（15：85），流速为1mL/min，柱温为30°C，检测波长为245nm。结果在含量测定中，（R-s）-告依春的质量浓度在1.6125～51.6ug/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系（R2=0.99954，n=6）。结论本方法快速、准确、精密度、稳定性、重复性好，可以测定板蓝根药材中（R-s）-告依春的含量。
[关键词]板蓝根提取物；高效液相色谱法；（P.-S）-告依春；含量测定
[中图分类号]R286.0
[文献标识码]B
[文章编号]2095-0616（2016）23-57-04
板蓝根为十字花科植物菘蓝（Isatis indigoticaFort）的干燥根，载于《神农本草经》中，是传统的抗病毒中药之一。长时间的临床调查与研究已经表明板蓝根具有清热解毒，凉血利咽的功效。可用于肺胃热导致的口干舌燥、咽喉肿痛、腮部肿胀、腮腺炎、急性扁桃体炎等症的治疗。板蓝根中含有靛玉红、（R-S）-告依春、蔗糖、靛蓝、氨基酸等多种有效成分，查阅相关文献可知，板蓝根的这几种成分都有相关学者在研究，并且得到了很多的研究成果。（R-S）-告依春是板蓝根中抗病毒的代表性成分，本研究旨在进一步制定板蓝根配方颗粒质量控制的新方法，为相关研究提供依据及参考。现将结果报道如下。
1.材料与仪器
1.1仪器
高效液相色谱仪紫外一可见光（型号：SPD-16，岛津仪器有限公司）；KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；（50mL、100mL、1000mL）量筒；微孔滤膜过滤装置；25mL容量瓶；万分之一天平。
1.2材料与试剂
板蓝根药材饮片（安徽源和堂药业股份有限公司，151021）；（R-S）-告依春对照品（中国食品药品检定研究所，251505）；甲醇。
2.板蓝根水提物的制备
以加水量、提取次数、提取时间作为三个研究因素来研究板蓝根的水提工艺。依据相关文献资料设置三个水平参数，优选出最佳的提取工艺。板蓝根提取工艺的提取流程为：用粉碎机将板蓝根饮片打粉，取2号及4号筛中间的粉末和4号筛筛下的粉末。每次按（过4号筛不超过40%）的比例取中间粉和筛下粉20g，用自来水提取，用正交设计法，设计出九组不同的加水量，提取次数，提取时间提取工艺，每一组平行重复三次，将每组提取得到的提取液放入离心机中离心。取离心过后提取液的上清液，置85℃水浴锅上水浴蒸发掉溶剂，将在水浴锅上蒸的粘稠浸膏放入60℃烘箱中烘干，得干浸膏，计算出膏率。
3.板蓝根浸膏中（R-S）-告依春的含量测定
3.1色谱条件
为了使（R-S）一告依春更好地显现在高效液相分析图中，需要确定一个有效的分析方法及检测条件。查阅相关文献，对影响供试品中（R-S）一告依春出峰的几个因素进行考察：色谱柱类型的选择，流动相的选择及流动相比例的选择，柱温箱温度的选择，流速的选择及检测器的选择等。
由于C18色谱柱具有适应性好，保留值大，稳定性好等诸多优点，已经作为高效液相中使用最广泛的色谱柱种类之一。色谱柱phenomenex（250ram×4.6mm，5um）的分离效果可以达到（R-S）-告依春很好的分离，故选用C18色谱柱phenomenex（250mm×4.6mm，5um）。
因为本次实验所用流动相的比例已经确定，故采用等度洗脱的方法，用甲醇和水作为流动相，流动相的比例为15：85。先把洗脱时间设计为30min，通过用对照品溶液的摸索，可以得到（R-S）-告依春大约在7.5min左右出峰。所以把洗脱时间设计为10min，每次的进样量为20uL，检测波长设为245nm，流速设为1mL/min，柱温箱的温度设为30℃。
3.2溶液的制备
3.2.1对照品溶液的制备用万分之一电子天平精密称取（R-S）-告依春对照品1.032mg，加入10mL容量瓶中，加入水至刻度，配成浓度为103.2ug/mL的对照品溶液。从103.2ug/mL对照品溶液中精密吸取1mL，并吸取1mL水，加入到刚才吸取的1mL对照品溶液中，配制成浓度为51.6ug/mL的对照品溶液，同样的方法配制浓度为1.6125ug/mL，3.225ug/mL，6.45ug/mL，12.9ug/mL，25.8ug/mL的对照品溶液。
3.2.2供试品溶液的制备精密称取一定量的板蓝根浸膏，相当于0.4g的板蓝根药材粉末，精密加入超纯水25mL，振荡摇匀使溶解。用针管和微孔滤膜将溶解过的板蓝根溶液过滤并注入EP管中，贴上标签，即得供试品溶液。
3.3系统适应性试验
分别取对照品及供试品溶液，按上述色谱条件进行色谱分析，记录检测所得到的色谱图。结果显示，在选定的色谱条件下，分离度为大于13，理论塔板数大于5000。见图1～2。
3.4线性关系的考察及标准曲线的绘制
精密量取（R-S）-告依春对照品储备溶液（51.6ug/mL）1mL，分别稀释成浓度为25.8斗咖L，12.9ug/mL，6.45ug/mL，3.225ug/mL，1.6125ug/mL的對照品溶液，按低浓度至高浓度依次各进样20uL，注入高效液相色谱仪中，测定各个对照品溶液的峰面积值，把各个对照品溶液浓度作为横坐标，把各个对照品溶液检测到的峰面积值作为纵坐标，以此绘制出标准曲线。得出（R-S）-告依春的标准曲线为：y=81943x-14683，R2=0.99954。结果表明（R-S）-告依春对照品溶液在浓度为1.625～51.6ug/mL的范围内与其峰面积呈良好的线性关系。见表1、图3。 3.5精密度实验
取同一浓度的（R-S）一告依春对照品溶液（浓度是51.6ug/mL），进样量为20uL，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，6次峰面积的RSD为1.20%。表明高效液相色谱仪的精密度良好。见表2。
3.6稳定性试验
取正交实验的第7次实验（25倍水，提取1次，每次75rain）所得到的浸膏，这次实验的浸膏得率为31.14%。精密称定，按“供试品溶液制定”项下的配制方法配制供试品溶液，放冰箱内备用。分别于0，2，4，8，12，24h精密吸取供试品溶液20uL，注入高效液相色谱仪中。由于峰面积的RSD=1.26%，表明供试品溶液在24h内保持稳定。见表3。
3.7重复性实验
取正交实验的第9次試验（25倍水，提取3次，每次75min）所得到的浸膏，这次实验的浸膏得率为43.27%，精密量取浸膏0.17308g，一共称取6份。将称取得浸膏放入25mL容量瓶中，加超纯水至容量瓶的刻度线。振荡摇匀使溶解。将配制好的供试品溶液用针管通过微孔滤膜注入EP管中，既得所需的供试品溶液。将配制好的6份供试品溶液按顺序注入高效液相色谱仪中，进样量为20uL。高效液相色谱仪所测得的参数如下表4所示。由于峰面积的RSD=2.49%，表明该实验方法的重复性好。见表4。
3.8加样回收率实验
取已知同一供试品6份，配制成供试品溶液，经高效液相及标准曲线算得其浓度为12.57ug/mL，取供试品溶液0.1mL，再取浓度为1.6125ug/mL的对照品溶液0.9mL，将两者混匀，制成新的供试品溶液；取供试品溶液（浓度为12.57ug，mL）1mL，浓度为6.45ug/mL的对照品溶液2mL，将两者混匀，制成另一种新的供试品溶液；再取供试品溶液（浓度为12.57u/mL）1mL，浓度为51.6ug/mL的对照品溶液0.25mL，将两者混匀，制成第三种供试品溶液。依次注入高效液相色谱仪中，所得参数如下表5所示。根据公式：加样回收率=实际测得的量（ug）一供试品中所含（R-S）-告依春的量（ug）/加入对照品的量（ug）×100%。见表5。
4.讨论
本论文研究了用高效液相色谱法测定板蓝根水提物中（R-S）-告依春的含量，该法重复性好，准确度高。但是，做高效液相所使用的色谱条件不同也会影响高效液相的效率，检测波长依据《中国药典》现行版一部板蓝根项下的规定，测定波长为245nm。在流动相及流动相的比例选择上，经查阅大量文献资料了解到，以甲醇一水为流动相时响应值好，峰形良好，理论塔板数，分离度等符合要求。
在提取溶剂的选择上，查阅大量文献。由于（R-S）-告依春为水溶性成分，所以直接用水对样品进行稀释处理，操作方便，经济节省，对环境无污染。
中国药典中药材品的检验标准一般都较成熟，本文的研究思路是参考药典拓展开来，还存在不足之处，尚需进一步深入研究。
[关键词]板蓝根提取物；高效液相色谱法；（P.-S）-告依春；含量测定
[中图分类号]R286.0
[文献标识码]B
[文章编号]2095-0616（2016）23-57-04
板蓝根为十字花科植物菘蓝（Isatis indigoticaFort）的干燥根，载于《神农本草经》中，是传统的抗病毒中药之一。长时间的临床调查与研究已经表明板蓝根具有清热解毒，凉血利咽的功效。可用于肺胃热导致的口干舌燥、咽喉肿痛、腮部肿胀、腮腺炎、急性扁桃体炎等症的治疗。板蓝根中含有靛玉红、（R-S）-告依春、蔗糖、靛蓝、氨基酸等多种有效成分，查阅相关文献可知，板蓝根的这几种成分都有相关学者在研究，并且得到了很多的研究成果。（R-S）-告依春是板蓝根中抗病毒的代表性成分，本研究旨在进一步制定板蓝根配方颗粒质量控制的新方法，为相关研究提供依据及参考。现将结果报道如下。
1.材料与仪器
1.1仪器
高效液相色谱仪紫外一可见光（型号：SPD-16，岛津仪器有限公司）；KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；（50mL、100mL、1000mL）量筒；微孔滤膜过滤装置；25mL容量瓶；万分之一天平。
1.2材料与试剂
板蓝根药材饮片（安徽源和堂药业股份有限公司，151021）；（R-S）-告依春对照品（中国食品药品检定研究所，251505）；甲醇。
2.板蓝根水提物的制备
以加水量、提取次数、提取时间作为三个研究因素来研究板蓝根的水提工艺。依据相关文献资料设置三个水平参数，优选出最佳的提取工艺。板蓝根提取工艺的提取流程为：用粉碎机将板蓝根饮片打粉，取2号及4号筛中间的粉末和4号筛筛下的粉末。每次按（过4号筛不超过40%）的比例取中间粉和筛下粉20g，用自来水提取，用正交设计法，设计出九组不同的加水量，提取次数，提取时间提取工艺，每一组平行重复三次，将每组提取得到的提取液放入离心机中离心。取离心过后提取液的上清液，置85℃水浴锅上水浴蒸发掉溶剂，将在水浴锅上蒸的粘稠浸膏放入60℃烘箱中烘干，得干浸膏，计算出膏率。
3.板蓝根浸膏中（R-S）-告依春的含量测定
3.1色谱条件
为了使（R-S）一告依春更好地显现在高效液相分析图中，需要确定一个有效的分析方法及检测条件。查阅相关文献，对影响供试品中（R-S）一告依春出峰的几个因素进行考察：色谱柱类型的选择，流动相的选择及流动相比例的选择，柱温箱温度的选择，流速的选择及检测器的选择等。
由于C18色谱柱具有适应性好，保留值大，稳定性好等诸多优点，已经作为高效液相中使用最广泛的色谱柱种类之一。色谱柱phenomenex（250ram×4.6mm，5um）的分离效果可以达到（R-S）-告依春很好的分离，故选用C18色谱柱phenomenex（250mm×4.6mm，5um）。
因为本次实验所用流动相的比例已经确定，故采用等度洗脱的方法，用甲醇和水作为流动相，流动相的比例为15：85。先把洗脱时间设计为30min，通过用对照品溶液的摸索，可以得到（R-S）-告依春大约在7.5min左右出峰。所以把洗脱时间设计为10min，每次的进样量为20uL，检测波长设为245nm，流速设为1mL/min，柱温箱的温度设为30℃。
3.2溶液的制备
3.2.1对照品溶液的制备用万分之一电子天平精密称取（R-S）-告依春对照品1.032mg，加入10mL容量瓶中，加入水至刻度，配成浓度为103.2ug/mL的对照品溶液。从103.2ug/mL对照品溶液中精密吸取1mL，并吸取1mL水，加入到刚才吸取的1mL对照品溶液中，配制成浓度为51.6ug/mL的对照品溶液，同样的方法配制浓度为1.6125ug/mL，3.225ug/mL，6.45ug/mL，12.9ug/mL，25.8ug/mL的对照品溶液。
3.2.2供试品溶液的制备精密称取一定量的板蓝根浸膏，相当于0.4g的板蓝根药材粉末，精密加入超纯水25mL，振荡摇匀使溶解。用针管和微孔滤膜将溶解过的板蓝根溶液过滤并注入EP管中，贴上标签，即得供试品溶液。
3.3系统适应性试验
分别取对照品及供试品溶液，按上述色谱条件进行色谱分析，记录检测所得到的色谱图。结果显示，在选定的色谱条件下，分离度为大于13，理论塔板数大于5000。见图1～2。
3.4线性关系的考察及标准曲线的绘制
精密量取（R-S）-告依春对照品储备溶液（51.6ug/mL）1mL，分别稀释成浓度为25.8斗咖L，12.9ug/mL，6.45ug/mL，3.225ug/mL，1.6125ug/mL的對照品溶液，按低浓度至高浓度依次各进样20uL，注入高效液相色谱仪中，测定各个对照品溶液的峰面积值，把各个对照品溶液浓度作为横坐标，把各个对照品溶液检测到的峰面积值作为纵坐标，以此绘制出标准曲线。得出（R-S）-告依春的标准曲线为：y=81943x-14683，R2=0.99954。结果表明（R-S）-告依春对照品溶液在浓度为1.625～51.6ug/mL的范围内与其峰面积呈良好的线性关系。见表1、图3。 3.5精密度实验
取同一浓度的（R-S）一告依春对照品溶液（浓度是51.6ug/mL），进样量为20uL，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，6次峰面积的RSD为1.20%。表明高效液相色谱仪的精密度良好。见表2。
3.6稳定性试验
取正交实验的第7次实验（25倍水，提取1次，每次75rain）所得到的浸膏，这次实验的浸膏得率为31.14%。精密称定，按“供试品溶液制定”项下的配制方法配制供试品溶液，放冰箱内备用。分别于0，2，4，8，12，24h精密吸取供试品溶液20uL，注入高效液相色谱仪中。由于峰面积的RSD=1.26%，表明供试品溶液在24h内保持稳定。见表3。
3.7重复性实验
取正交实验的第9次試验（25倍水，提取3次，每次75min）所得到的浸膏，这次实验的浸膏得率为43.27%，精密量取浸膏0.17308g，一共称取6份。将称取得浸膏放入25mL容量瓶中，加超纯水至容量瓶的刻度线。振荡摇匀使溶解。将配制好的供试品溶液用针管通过微孔滤膜注入EP管中，既得所需的供试品溶液。将配制好的6份供试品溶液按顺序注入高效液相色谱仪中，进样量为20uL。高效液相色谱仪所测得的参数如下表4所示。由于峰面积的RSD=2.49%，表明该实验方法的重复性好。见表4。
3.8加样回收率实验
取已知同一供试品6份，配制成供试品溶液，经高效液相及标准曲线算得其浓度为12.57ug/mL，取供试品溶液0.1mL，再取浓度为1.6125ug/mL的对照品溶液0.9mL，将两者混匀，制成新的供试品溶液；取供试品溶液（浓度为12.57ug，mL）1mL，浓度为6.45ug/mL的对照品溶液2mL，将两者混匀，制成另一种新的供试品溶液；再取供试品溶液（浓度为12.57u/mL）1mL，浓度为51.6ug/mL的对照品溶液0.25mL，将两者混匀，制成第三种供试品溶液。依次注入高效液相色谱仪中，所得参数如下表5所示。根据公式：加样回收率=实际测得的量（ug）一供试品中所含（R-S）-告依春的量（ug）/加入对照品的量（ug）×100%。见表5。
4.讨论
本论文研究了用高效液相色谱法测定板蓝根水提物中（R-S）-告依春的含量，该法重复性好，准确度高。但是，做高效液相所使用的色谱条件不同也会影响高效液相的效率，检测波长依据《中国药典》现行版一部板蓝根项下的规定，测定波长为245nm。在流动相及流动相的比例选择上，经查阅大量文献资料了解到，以甲醇一水为流动相时响应值好，峰形良好，理论塔板数，分离度等符合要求。
在提取溶剂的选择上，查阅大量文献。由于（R-S）-告依春为水溶性成分，所以直接用水对样品进行稀释处理，操作方便，经济节省，对环境无污染。
中国药典中药材品的检验标准一般都较成熟，本文的研究思路是参考药典拓展开来，还存在不足之处，尚需进一步深入研究。