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摘要：目的：建立用高效液相色谱法测定痛舒片中野黄芩苷含量的方法。方法：用waters XTerra C18柱（5μm，4.6×250 mm）色谱柱；流动相：甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）；检测波长335 nm；柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL。结果：对照品线性范围为0.1316μg～2.632μg，相关系数0.9997，平均回收率为100.64%，RSD=1.22%（n=9）。结论：该方法简便可行，重复性好，能有效控制痛舒片的质量。
关键词：痛舒片；野黄芩苷；高效液相色谱法
中图分类号：R284.2文献标志码：A
文章编号：1007-2349（2013）07-0051-03
痛舒片由云南省药物研究所制药厂生产，由七叶莲、三七、灯盏细辛、玉葡萄根等组成，对治疗跌打损伤、风湿性关节痛、肩周炎、痛风性关节痛、乳腺小叶增生等疾病有显著疗效。灯盏细辛作为其处方中药味之一，具有活血通络止痛，祛风散寒之功效，用于中风偏瘫，胸痹心痛，风湿痹痛[1]。野黄芩苷为灯盏细辛的有效成分，具有降低脑血管阻力，改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用。同时，野黄芩苷也是中国药典规定的灯盏细辛药材中的主要检验指标。在痛舒片药品质量标准中未对野黄芩苷的含量进行控制，本文以灯盏细辛的有效成分野黄芩苷为对照，对HPLC测定痛舒片中野黄芩苷含量的方法进行研究，确定了易控的高效液相色谱方法。
1实验部分
1.1仪器与试药美国Agilent1100高效液相色谱仪：包含四元泵、DAD检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及HP化学工作站；SK3200LH超声波处理器；痛舒片（批号：100831、100929、110211、110315、110627、110719、110808、110826、110923、111012），由云南省药物研究所制药厂提供；野黄芩苷对照品（批号：110842-200403），供含量测定用（纯度97.12℅），由中国药品生物制品检定所提供；所用流动相甲醇、四氢呋喃为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水，处理样品的甲醇为分析纯。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件色谱柱：Waters XTerra C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流动相：甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）；流速：1.0 mL/min；检测波长：335 nm；进样量：5 μL；柱温为30℃。理论塔板按野黄芩苷计算不低于4000，在该色谱条件下，供试品、对照品分离较好，与其他杂质峰均能达到基线分离。
1.2.2溶液的制备取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。取本品20片，研细，取约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声处理（功率135 W，频率40HZ）30 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。依处方比例制备缺灯盏细辛的阴性对照品，按上述供试品溶液处理方法制备阴性供试品溶液。
1.2.3系统适应性试验按供试品溶液制备方法制备供试品溶液和缺灯盏细辛的阴性供试品溶液，按上述色谱条件分别进样对照品、供试品、阴性样品各5 μL，结果见图1。由图谱可以看出供试品溶液色谱中与对照品溶液色谱相应的位置上有相同的色谱峰出现，而阴性样品无此峰出现，表明处方中其他成分对成品中野黄芩苷的含量测定无干扰。
1.2.4线性关系考察精密称取野黄芩苷对照品（纯度97.12℅）27.10 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得对照品储备液（0.5264 mg/mL）。精密吸取此溶液并加甲醇稀释成0.02632、0.05264、0.07896、0.15792、0.21056、0.2632、0.5264 mg/mL的对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进样5μl测定。以对照品溶液含量（μg）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为：y=1313.7x-24.861，相关系数r=0.9997。结果表明，在上述色谱条件下，野黄芩苷在0.1316 μg～2.632 μg范围内呈良好的线性关系。
1.2.5加样回收率试验精密称取9份供试品（批号：110826，已测含量为0.175℅，每份约0.6 g，对照品浓度0.1056 mg/mL），分别加浓度为0.1056 mg/mL对照品8、8、8、10、10、10、12、12、12 mL，然后按供试品溶液处理方法同法处理，将处理好的供试品溶液按含量测定方法同法测定，计算：平均回收率=100.64，RSD=1.22℅（n=9）。结果见表1。
1.2.7重复性试验取供试品6份，按供试品制备方法处理，测定野黄芩苷含量，结果RSD=1.2%（n=6），表明本法具有良好的重复性。
1.2.8稳定性试验精密吸取对照品溶液5 μL，按测定方法分别于0、1、2、6、9、12、24h进样，测定野黄芩苷的峰面积，RSD=0.77%（n=7），结果表明供试品溶液在24h内稳定。
1.2.9样品测定取10批样品按含量测定方法测定野黄芩苷的含量，结果见表2。
2讨论
2.1样品前处理方法的选择
2.1.1提取溶剂、溶剂体积及提取方法的选择根据野黄芩苷的理化性质，文献[2～4]多采用甲醇或70%甲醇作为提取溶媒，经试验，结果表明甲醇提取野黄芩苷效果好，且峰型较好。故确定以甲醇作为提取溶剂。同时比较了定容至10 mL，25 mL，与定容至50 mL 3种不同溶剂体积对提取的影响，结果表明25 mL的溶剂已经可以完全提取出样品中的野黄芩苷，为节省溶剂，确定以25 mL为提取溶剂体积。同时比较了超声，回流二种方法，结果表明都能将野黄芩苷较完全的提取出来，但回流提取方法操作较繁琐，超声提取法对仪器要求简单，操作简便，提取时间短，无需加热。故在本试验中，选择了超声法来提取野黄芩苷。
2.1.2提取时间的选择取本品（批号110826）1.0 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，分别按20、30、40 min 3个不同时间进行超声处理，放冷，加甲醇定容至刻度。摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。分别取上述供试液5 μL进样，进行含量测定，结果表明超声30 min已提取较为完全，所以确定提取时间为30 min。
2.2流动相的选择通过查阅文献，比较了以下几种不同比例的流动相系统：（1）甲醇-0.1%磷酸溶液（40：60）；（2）甲醇-四氢呋喃-0.2%磷酸溶液（13：13：74）；（3）甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）。试验结果表明，方法（1）分离色谱峰效果差，方法（2）峰的对称性较差，方法（3）所得峰形佳，基线平稳，野黄芩苷峰与其它峰达到很好的分离，故选择甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）作为流动相。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2]孙平川，邓亚利，郭惠琴，等.HPLC法测定心脑联通片中野黄芩苷的含量[J].西北药学杂志，2008，23（5）：290～291.
[3]张明伟，廖亚玲.高效液相色谱法测定灯盏花素微乳中野黄芩苷的含量[J].中国医院药学杂志，2010，30（16）：1415～1416.
[4]李树国，时贞平，付坤华，等.HPLC法测定灯盏花素片中野黄芩苷的含量[J].南京中医药大学学报，2010，26（6）：477～478.
（收稿日期：2013-05-02）
关键词：痛舒片；野黄芩苷；高效液相色谱法
中图分类号：R284.2文献标志码：A
文章编号：1007-2349（2013）07-0051-03
痛舒片由云南省药物研究所制药厂生产，由七叶莲、三七、灯盏细辛、玉葡萄根等组成，对治疗跌打损伤、风湿性关节痛、肩周炎、痛风性关节痛、乳腺小叶增生等疾病有显著疗效。灯盏细辛作为其处方中药味之一，具有活血通络止痛，祛风散寒之功效，用于中风偏瘫，胸痹心痛，风湿痹痛[1]。野黄芩苷为灯盏细辛的有效成分，具有降低脑血管阻力，改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用。同时，野黄芩苷也是中国药典规定的灯盏细辛药材中的主要检验指标。在痛舒片药品质量标准中未对野黄芩苷的含量进行控制，本文以灯盏细辛的有效成分野黄芩苷为对照，对HPLC测定痛舒片中野黄芩苷含量的方法进行研究，确定了易控的高效液相色谱方法。
1实验部分
1.1仪器与试药美国Agilent1100高效液相色谱仪：包含四元泵、DAD检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及HP化学工作站；SK3200LH超声波处理器；痛舒片（批号：100831、100929、110211、110315、110627、110719、110808、110826、110923、111012），由云南省药物研究所制药厂提供；野黄芩苷对照品（批号：110842-200403），供含量测定用（纯度97.12℅），由中国药品生物制品检定所提供；所用流动相甲醇、四氢呋喃为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水，处理样品的甲醇为分析纯。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件色谱柱：Waters XTerra C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流动相：甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）；流速：1.0 mL/min；检测波长：335 nm；进样量：5 μL；柱温为30℃。理论塔板按野黄芩苷计算不低于4000，在该色谱条件下，供试品、对照品分离较好，与其他杂质峰均能达到基线分离。
1.2.2溶液的制备取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。取本品20片，研细，取约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声处理（功率135 W，频率40HZ）30 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。依处方比例制备缺灯盏细辛的阴性对照品，按上述供试品溶液处理方法制备阴性供试品溶液。
1.2.3系统适应性试验按供试品溶液制备方法制备供试品溶液和缺灯盏细辛的阴性供试品溶液，按上述色谱条件分别进样对照品、供试品、阴性样品各5 μL，结果见图1。由图谱可以看出供试品溶液色谱中与对照品溶液色谱相应的位置上有相同的色谱峰出现，而阴性样品无此峰出现，表明处方中其他成分对成品中野黄芩苷的含量测定无干扰。
1.2.4线性关系考察精密称取野黄芩苷对照品（纯度97.12℅）27.10 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得对照品储备液（0.5264 mg/mL）。精密吸取此溶液并加甲醇稀释成0.02632、0.05264、0.07896、0.15792、0.21056、0.2632、0.5264 mg/mL的对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进样5μl测定。以对照品溶液含量（μg）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为：y=1313.7x-24.861，相关系数r=0.9997。结果表明，在上述色谱条件下，野黄芩苷在0.1316 μg～2.632 μg范围内呈良好的线性关系。
1.2.5加样回收率试验精密称取9份供试品（批号：110826，已测含量为0.175℅，每份约0.6 g，对照品浓度0.1056 mg/mL），分别加浓度为0.1056 mg/mL对照品8、8、8、10、10、10、12、12、12 mL，然后按供试品溶液处理方法同法处理，将处理好的供试品溶液按含量测定方法同法测定，计算：平均回收率=100.64，RSD=1.22℅（n=9）。结果见表1。
1.2.7重复性试验取供试品6份，按供试品制备方法处理，测定野黄芩苷含量，结果RSD=1.2%（n=6），表明本法具有良好的重复性。
1.2.8稳定性试验精密吸取对照品溶液5 μL，按测定方法分别于0、1、2、6、9、12、24h进样，测定野黄芩苷的峰面积，RSD=0.77%（n=7），结果表明供试品溶液在24h内稳定。
1.2.9样品测定取10批样品按含量测定方法测定野黄芩苷的含量，结果见表2。
2讨论
2.1样品前处理方法的选择
2.1.1提取溶剂、溶剂体积及提取方法的选择根据野黄芩苷的理化性质，文献[2～4]多采用甲醇或70%甲醇作为提取溶媒，经试验，结果表明甲醇提取野黄芩苷效果好，且峰型较好。故确定以甲醇作为提取溶剂。同时比较了定容至10 mL，25 mL，与定容至50 mL 3种不同溶剂体积对提取的影响，结果表明25 mL的溶剂已经可以完全提取出样品中的野黄芩苷，为节省溶剂，确定以25 mL为提取溶剂体积。同时比较了超声，回流二种方法，结果表明都能将野黄芩苷较完全的提取出来，但回流提取方法操作较繁琐，超声提取法对仪器要求简单，操作简便，提取时间短，无需加热。故在本试验中，选择了超声法来提取野黄芩苷。
2.1.2提取时间的选择取本品（批号110826）1.0 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，分别按20、30、40 min 3个不同时间进行超声处理，放冷，加甲醇定容至刻度。摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。分别取上述供试液5 μL进样，进行含量测定，结果表明超声30 min已提取较为完全，所以确定提取时间为30 min。
2.2流动相的选择通过查阅文献，比较了以下几种不同比例的流动相系统：（1）甲醇-0.1%磷酸溶液（40：60）；（2）甲醇-四氢呋喃-0.2%磷酸溶液（13：13：74）；（3）甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）。试验结果表明，方法（1）分离色谱峰效果差，方法（2）峰的对称性较差，方法（3）所得峰形佳，基线平稳，野黄芩苷峰与其它峰达到很好的分离，故选择甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）作为流动相。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2]孙平川，邓亚利，郭惠琴，等.HPLC法测定心脑联通片中野黄芩苷的含量[J].西北药学杂志，2008，23（5）：290～291.
[3]张明伟，廖亚玲.高效液相色谱法测定灯盏花素微乳中野黄芩苷的含量[J].中国医院药学杂志，2010，30（16）：1415～1416.
[4]李树国，时贞平，付坤华，等.HPLC法测定灯盏花素片中野黄芩苷的含量[J].南京中医药大学学报，2010，26（6）：477～478.
（收稿日期：2013-05-02）