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摘要：目的：建立复方罗布麻合剂的质量标准。方法：采用TLC法鉴别金丝桃苷;采用HPLC法检测金丝桃苷含量。色谱柱：WondaSil C18（150 mm×4.6 mm 5 μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（17：83）;柱温：30℃;流速：1.0 ml＼min;检测波长：360 nm;结果：薄层色谱法对金丝桃苷的鉴别效果好，重现性好，阴性对照无干扰。高效液相色谱法测定金丝桃苷的含量，其线性范围8.4825～127.2375 μg＼ml（r=0.99998），回收率为103.2%（RSD=1.9%）。结论：薄层色谱法操作简单、准确、重现性好，可以用于复方罗布麻合剂的质量控制。
维吾尔医药学是中华医药学宝库的璀璨明珠，她自成体系，独树一帜，具有显著的地域特色和民族特征，是经长期实践证明能战胜疾病、维护健康的有效利器。维吾尔药复方罗布麻合剂为库尔勒市中医医院（库尔勒市第三人民医院）（原库尔勒市维吾尔医医院）验方，由罗布麻叶、罗布麻花、菟丝草、对叶大戟果、甘松、牛舌草等6味药材组成，具有利尿消肿，改善血液循环作用，临床上主要用于高血压、动脉硬化。以现配现用形式少量供应临床，多年临床使用过程中以其明显的疗效得到广大患者好评。复方罗布麻合剂无质量标准，因此生产过程中很难保证其技术指标的稳定性。本研究通过对复方罗布麻合剂中的主要成分金丝桃苷进行研究，采用TLC法鉴别金丝桃苷，采用HPLC法测定金丝桃苷的含量，可以用于复方罗布麻合剂的质量控制，并通过实验确定稳定性、质量，为取得制剂批准文号做前期研究工作提供科学依据。
1仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津），包含自动进样器和LC Solution色谱数据工作站，紫外检测器;数控超声波清洗器（KQ-500 DE）;電子分析天平（XS205 DU）;半自动薄层点样仪（LinoMAT5）;薄层照相系统（CAMAG TLC Visualizer）。
1.2 材料
复方罗布麻合剂3批（批号：20180910，20180912，20180914），库尔勒市中医医院（库尔勒市第三人民医院）（原库尔勒市维吾尔医医院）;对照品：金丝桃苷（批号：111521-201708，供含量测定用，含量为95.1%），购于中国食品药品检定研究院;硅胶G薄层板（天津思利达科技有限公司，批号170612），乙腈（色谱纯，Fisher公司，美国），水为超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。
2鉴别
复方罗布麻合剂中金丝桃苷薄层色谱鉴别。按《中国药典》2015年版四部通则（0502）下方法，取本品20 ml，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次，每次30 ml，合并提取液，蒸干，残渣加1 ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。
3含量测定
复方罗布麻合剂中金丝桃苷含量照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则（0512）进行测定。
3.1 色谱条件的确定与系统适用性实验
填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（17：83），检测波长为360 nm。按金丝桃苷峰计算理论板数应不低于3000，取对照品溶液、供试品溶液各20 ?l，分别注入液相色谱仪，金丝桃苷的理论塔板数均大于3000，分离度大于1.5，符合要求。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取金丝桃苷对照品适量，精密稳定，加甲醇制成每1 ml含100 μg的溶液，即得。
3.3 供试品溶液的制备
取本品10 ml，加水10 ml混匀，用乙酸乙酯提取5次（40 ml、30 ml、30 ml、30 ml、30 ml），合并提取液，85℃水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至20 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性对照溶液的制备
阴性对照不含罗布麻叶、罗布麻花、菟丝草，其他成分均按复方罗布麻合剂的处方比例及制备方法配制，阴性对照溶液制备方法同供试品溶液。
3.5 标准曲线的制备
分别精密吸取上述金丝桃苷（浓度为169.65 μg/ml）对照品储备液，精密量取对照品储备液1，2，5，10，15 ml分别置于20 ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混合均匀，即得8.4825，16.9650，42.4125，84.8250，127.2375 μg/ml等系列质量浓度的对照品溶液。按照色谱条件，对系列质量浓度的对照品溶液取20 μl体积进样，记录金丝桃苷色谱峰的面积。以金丝桃苷对照品系列质量浓度x（μg/ml）对金丝桃苷峰面积值y进行线性回归，得线性回归方程y=ax+b（a=41538.2，b=-7866.16，r=0.99998），结果表明金丝桃苷质量浓度在8.4825～127.2375 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。
3.6 仪器精密度试验
金丝桃苷对照品溶液（浓度为20 μg/ml）分别进样5次，每次20 μl，金丝桃苷峰面积值分别为875918、873750、870893、871695、871636，平均为872778，RSD%为0.2%，结果表明仪器精密度良好。
3.7 阴性对照试验
分别取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液20 μl进样，记录各样品色谱图，结果如图所示，在对照品色谱峰保留时间处阴性对照的色谱图中无色谱峰出现，表明阴性样品无干扰。 3.8 重复性试验
取同一批复方罗布麻合剂样品6份，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按上述方法测定金丝桃苷的含量，结果得出供试品中金丝桃苷的含量分别为38.68 μg/ml，39.50 μg/ml，40.09 μg/ml，40.24 μg/ml，39.99 μg/ml，39.93 μg/ml，平均含量为39.74 μg/ml，计算RSD值为1.4%，结果表明方法重复性良好，HPLC色谱图。见图1。
3.9 加样回收率试验
精密量取已知含量的同批复方罗布麻合剂样品（样品金丝桃苷含量39.7 μg/ml）6份各5.0 ml，分别精密加入一定质量浓度（13.69 μg/ml）的对照品溶液3 ml，按供试品项下方法操作，制备供试品溶液，按色谱条件分别进样20 μl测定，计算回收率，平均回收率为103.1%，RSD为1.9%。见表1。
3.10 供试品稳定性试验
取1号样品，按含量测定项下的方法制成供试品溶液，分别取20 μl于配制后0，2，4，8，16，24 h测定金丝桃苷峰面积积分值，分别为817219，820226，830432，827049，833384，835693，平均值为827334，计算RSD值为0.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
3.11 空白干扰试验
在各自色谱条件下，分别以流动相与甲醇作为空白供试品溶液。从液相色谱图可看出，空白供试品溶液与对照品溶液在相同时间无相同的保留峰，对金丝桃苷的含量测定无干扰。
3.12 样品的测定
分别取3个不同批次的复方罗布麻合剂样品，按上述方法将每批样品制得编号为1，2和3的样品溶液，经高效液相法测定，计算得出金丝桃苷的峰面积。根据标准曲线方程，计算样品中金丝桃苷的含量，结果3批样品溶液中金丝桃苷的平均质量浓度分别为38.68，39.50，40.09 μg/ml。
4討论
4.1 流动相的确定
除了采用含量测定项下的流动相，还使用了乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）为流动相;检测波长为256 nm。实验结果表明，含量测定项下的流动相是测定复方罗布麻合剂中金丝桃苷含量的较为理想的流动相。
4.2 色谱柱的选择
利用WondaSil C18中药分析专用柱，柱长150 mm与250 mm及岛津Shim-Pack VP-ODS色谱柱分别比对检测，结果表明，三种色谱柱的分离效果都很好。柱长150 mm的WondaSil C18中药分析专用柱分离效果好，分离相对较短。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典2015年版[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局.新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范2010年版[S].一部.新疆：新疆人民卫生出版社，2010.
维吾尔医药学是中华医药学宝库的璀璨明珠，她自成体系，独树一帜，具有显著的地域特色和民族特征，是经长期实践证明能战胜疾病、维护健康的有效利器。维吾尔药复方罗布麻合剂为库尔勒市中医医院（库尔勒市第三人民医院）（原库尔勒市维吾尔医医院）验方，由罗布麻叶、罗布麻花、菟丝草、对叶大戟果、甘松、牛舌草等6味药材组成，具有利尿消肿，改善血液循环作用，临床上主要用于高血压、动脉硬化。以现配现用形式少量供应临床，多年临床使用过程中以其明显的疗效得到广大患者好评。复方罗布麻合剂无质量标准，因此生产过程中很难保证其技术指标的稳定性。本研究通过对复方罗布麻合剂中的主要成分金丝桃苷进行研究，采用TLC法鉴别金丝桃苷，采用HPLC法测定金丝桃苷的含量，可以用于复方罗布麻合剂的质量控制，并通过实验确定稳定性、质量，为取得制剂批准文号做前期研究工作提供科学依据。
1仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津），包含自动进样器和LC Solution色谱数据工作站，紫外检测器;数控超声波清洗器（KQ-500 DE）;電子分析天平（XS205 DU）;半自动薄层点样仪（LinoMAT5）;薄层照相系统（CAMAG TLC Visualizer）。
1.2 材料
复方罗布麻合剂3批（批号：20180910，20180912，20180914），库尔勒市中医医院（库尔勒市第三人民医院）（原库尔勒市维吾尔医医院）;对照品：金丝桃苷（批号：111521-201708，供含量测定用，含量为95.1%），购于中国食品药品检定研究院;硅胶G薄层板（天津思利达科技有限公司，批号170612），乙腈（色谱纯，Fisher公司，美国），水为超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。
2鉴别
复方罗布麻合剂中金丝桃苷薄层色谱鉴别。按《中国药典》2015年版四部通则（0502）下方法，取本品20 ml，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次，每次30 ml，合并提取液，蒸干，残渣加1 ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。
3含量测定
复方罗布麻合剂中金丝桃苷含量照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则（0512）进行测定。
3.1 色谱条件的确定与系统适用性实验
填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（17：83），检测波长为360 nm。按金丝桃苷峰计算理论板数应不低于3000，取对照品溶液、供试品溶液各20 ?l，分别注入液相色谱仪，金丝桃苷的理论塔板数均大于3000，分离度大于1.5，符合要求。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取金丝桃苷对照品适量，精密稳定，加甲醇制成每1 ml含100 μg的溶液，即得。
3.3 供试品溶液的制备
取本品10 ml，加水10 ml混匀，用乙酸乙酯提取5次（40 ml、30 ml、30 ml、30 ml、30 ml），合并提取液，85℃水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至20 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 阴性对照溶液的制备
阴性对照不含罗布麻叶、罗布麻花、菟丝草，其他成分均按复方罗布麻合剂的处方比例及制备方法配制，阴性对照溶液制备方法同供试品溶液。
3.5 标准曲线的制备
分别精密吸取上述金丝桃苷（浓度为169.65 μg/ml）对照品储备液，精密量取对照品储备液1，2，5，10，15 ml分别置于20 ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混合均匀，即得8.4825，16.9650，42.4125，84.8250，127.2375 μg/ml等系列质量浓度的对照品溶液。按照色谱条件，对系列质量浓度的对照品溶液取20 μl体积进样，记录金丝桃苷色谱峰的面积。以金丝桃苷对照品系列质量浓度x（μg/ml）对金丝桃苷峰面积值y进行线性回归，得线性回归方程y=ax+b（a=41538.2，b=-7866.16，r=0.99998），结果表明金丝桃苷质量浓度在8.4825～127.2375 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。
3.6 仪器精密度试验
金丝桃苷对照品溶液（浓度为20 μg/ml）分别进样5次，每次20 μl，金丝桃苷峰面积值分别为875918、873750、870893、871695、871636，平均为872778，RSD%为0.2%，结果表明仪器精密度良好。
3.7 阴性对照试验
分别取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液20 μl进样，记录各样品色谱图，结果如图所示，在对照品色谱峰保留时间处阴性对照的色谱图中无色谱峰出现，表明阴性样品无干扰。 3.8 重复性试验
取同一批复方罗布麻合剂样品6份，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按上述方法测定金丝桃苷的含量，结果得出供试品中金丝桃苷的含量分别为38.68 μg/ml，39.50 μg/ml，40.09 μg/ml，40.24 μg/ml，39.99 μg/ml，39.93 μg/ml，平均含量为39.74 μg/ml，计算RSD值为1.4%，结果表明方法重复性良好，HPLC色谱图。见图1。
3.9 加样回收率试验
精密量取已知含量的同批复方罗布麻合剂样品（样品金丝桃苷含量39.7 μg/ml）6份各5.0 ml，分别精密加入一定质量浓度（13.69 μg/ml）的对照品溶液3 ml，按供试品项下方法操作，制备供试品溶液，按色谱条件分别进样20 μl测定，计算回收率，平均回收率为103.1%，RSD为1.9%。见表1。
3.10 供试品稳定性试验
取1号样品，按含量测定项下的方法制成供试品溶液，分别取20 μl于配制后0，2，4，8，16，24 h测定金丝桃苷峰面积积分值，分别为817219，820226，830432，827049，833384，835693，平均值为827334，计算RSD值为0.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
3.11 空白干扰试验
在各自色谱条件下，分别以流动相与甲醇作为空白供试品溶液。从液相色谱图可看出，空白供试品溶液与对照品溶液在相同时间无相同的保留峰，对金丝桃苷的含量测定无干扰。
3.12 样品的测定
分别取3个不同批次的复方罗布麻合剂样品，按上述方法将每批样品制得编号为1，2和3的样品溶液，经高效液相法测定，计算得出金丝桃苷的峰面积。根据标准曲线方程，计算样品中金丝桃苷的含量，结果3批样品溶液中金丝桃苷的平均质量浓度分别为38.68，39.50，40.09 μg/ml。
4討论
4.1 流动相的确定
除了采用含量测定项下的流动相，还使用了乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）为流动相;检测波长为256 nm。实验结果表明，含量测定项下的流动相是测定复方罗布麻合剂中金丝桃苷含量的较为理想的流动相。
4.2 色谱柱的选择
利用WondaSil C18中药分析专用柱，柱长150 mm与250 mm及岛津Shim-Pack VP-ODS色谱柱分别比对检测，结果表明，三种色谱柱的分离效果都很好。柱长150 mm的WondaSil C18中药分析专用柱分离效果好，分离相对较短。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典2015年版[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局.新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范2010年版[S].一部.新疆：新疆人民卫生出版社，2010.