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【摘要】 目的 在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。方法 用VITEK-AMS微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用PCR方法扩增I类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。结果 158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率。攜带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%（33/48），明显高于1类整合子阴性菌株（28.6%），P<0.05。结论 1类整合子广泛存在铜绿假单胞菌中，1类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用，应加强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效措施防止耐药性的传播。
【关键词】 铜绿假单胞菌；整合子；多重耐药
随着抗生素的广泛使用和不合理使用，细菌的耐药性问题日益严重。铜绿假单胞菌是引起医院感染重要的条件致病菌，对严重基础性疾病和免疫缺陷的住院患者常导致侵袭性感染，会对患者的生命产生严重威胁。铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，面对不同的抗生素耐药，会使得感染源频繁发生，更有可能会引起部分铜绿假单胞菌的流行，变成难以解决的医学难题，分析细菌整合子的耐药基因的类别和表达，能够帮助对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解，给临床治疗提供有效的参考。本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 2012年3月——2012年10月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自ICU病房（53株）、呼吸科病房（49株）、普外科病房（28株）、泌尿科病房（16株）和内分泌病房（12株）。菌株分别分离自痰标本（68株）、脓汁（42株）、咽拭子（18株）、尿标本（12株）、伤口分泌物（10株）和血液（8株）。标准质控菌株为铜绿假单胞菌（ATCC27853）。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。
1.1.2 鉴定卡片 全自动微生物分析仪（VITEK-AMS）采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司，GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物。
1.1.3 PCR试剂 TaqDNA聚合酶，4种dNTP混合液，DNA分子标准参照物购自Takara公司；琼脂糖，溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。
1.1.4 主要仪器 VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司；PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf公司；PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品；DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株鉴定 所有菌株都用VITEK AMS 分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEK AMS规定的方法进行。
1.2.2 加热裂解法制备DNA模板 用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。
1.2.3 筛选1型整合子阳性菌株 用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为：DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟；94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分钟，循环35次；最后72℃延伸10分钟。
1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果
1.2.5 统计学处理 采用χ2检验，P<0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。
2 结 果
2.1 1类整合子基因检测结果 全部158株铜绿假单胞菌的DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱，见下图。
2.2 1类整合子阳性菌株与耐药性的关系 对比1类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，见表1。
1类整合子阴性菌株对11种抗菌药物完全敏感率为54.4%（86/158）。1类整合子阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药。耐药率最高的是复方新诺明（100%）其次为氨苄青霉素（90.5%）和庆大霉素（85.7%），丁胺卡那也表现出较高的耐药率（76.7%）。1类整合子阳性菌株对6种药物的耐药率显著高于阴性菌株，P<0.05。
2.3 1类整合子与多重耐药率的相关性 多重耐药率（耐4种以上抗生素）为62.0%（98/158），其中1类整合子阳性菌株多重耐药率占85.7%（36/42），阴性菌株多重耐药率为20.7%（24/116）。1类整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株，差异有统计学意义（χ2=55.31，P<0.01）。
3 讨 论 整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可以捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药[1]给临床治疗带来极大的困难。整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌耐药性的发展，是细菌多重耐药性强化的根本因素。结合整合酶的特点，将其分成六种[2]分析临床的菌株最常见的是1类合子。这种整合子的基本结构包括三方面内容，两端是规整的序列，一般叫做5’CS和3’CS，5’CS和3’CS之间为可变区，可变区包括单个或多个外部的基因构成[3]。通过整合酶的作用，结合主要系统内容融合外部耐药金银，使得耐药基因不断发展，提升器细菌本书呢的耐药和多重耐药性。目前在1类整合子中发现的基因盒已超过80种，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床抗生素耐药。
我院铜绿假单胞菌占致病菌分离菌的第一位，高达两成以上，它是引发下呼吸道感染以及伤口感染的重要原因，另外其对多种抗生素具有耐药性，经常会引发感染，更可能会形成局部铜绿假单胞菌，是目前临床医学的重要研究内容，这和铜绿假单胞菌复杂的耐药机制有很大的关系[1]。研究细菌整合子的耐药基因种类和表达，可以有效提升对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解。
铜绿假单胞菌作为医院感染的重要的条件致病菌，在长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后的病人易导致本菌感染，该菌常常具有多重耐药的特点，因此其所造成的感染难以治愈，病死率高。而近年证实整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药的主要原因之一[4]。
本研究显示，铜绿假单胞菌在呼吸道的感染占首位为54.5%（86/158），这与大多数文献的报导相符合[5]究其原因，可能与铜绿假单胞菌容易定植于呼吸道，且由于气管插管、流感病毒感染及其他各种炎症等因素损害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，细菌易于移生、粘附有关。伤口创面也较易受其侵害，检出率32.9%（52/158），居第二位，与其存在广泛及医院环境的隔离消毒程度关系颇大。实验证明，我院患者分离的铜绿假单胞菌对多种抗生素出现高耐药，尤其是表现出对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、单环β-内酰胺类以及磺胺类等的多重耐药性，更是不容忽视。
由于抗生素使用量和种类日趋增多，使细菌生存面临更大的抗生素选择压力。本次研究客观反映了我院铜绿假单胞菌的整合子携带情况，分析本次结果发现在158株铜绿假单胞菌中检出42株整合子阳性，检出率为26.6%，与其他报道铜绿假单胞菌整合子检出率不完全相同[6]，这可能是由于地域的不同所造成的，也可能与菌株的来源有关。整合子阳性的细菌表现出多重耐药性比整合子阴性菌高，证实了整合子介导了多重耐药性产生。但由于铜绿假单胞菌耐药机制较为复杂，耐药性还与抗菌药物作用的靶位改变、OprD蛋白缺失引起的菌膜通透性下降、菌体细胞膜上主动外排泵系统的上调还有形成β-内酰胺酶等相关机制有关系，所以要强化对铜绿假单胞菌的耐药机制的研究，要加强这部分的分析，通过强有力的手段控制它的耐药性发展。抗生素应用的范围越大，其使用心得耐药基因的优势菌就变得更多，就会使得携带耐药基因菌群的数量增加，使得1类整合子多重耐药细菌提供了选择性压力，会增加它的耐药种类，使得其传播速度得到提高。所以，该耐药机制引起的细菌耐药应该引起临床的足够重视，加大监测力度，预防医院感染的发生。
参考文献
[1] Toleman MA，Bennett PM，Walsh TR.ISCR etements：novel gene —capturing systems of the 21st century [J].Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（2）：296-316.
[2] Van EssenZandbergen A，Smith H，Veldmanl K，et al.Occurrence and characteristics of class 1，2 and 3 integrons in Escherichia coli，Salmonella and Campylobacter spp.in the Netherlands[J].J Antimicrob Chemother，2007，59：746-758.
[3] Mazel D.Integrons：agents of bacterial evolution [J].Nat Rev Microbiol，2006，4（8）：608-620.
[4] 廖如燕，陈珍玲，周霓，等.广东地区医院分离铜绿假单胞菌整合子及其攜带耐药基因的研究[J].中国消毒学杂志，2012，29（3）：183-187.
[5] 王志锐，李力，张坚磊，等.耐药铜绿假单胞菌携带的整合子及其耐药基因盒检测分析[J].中华检验医学杂志，2007，30（7）：802-803.
[6] 杨维青，石磊，尹晓琳，等.不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布[J].中国抗生素杂志，2006，31（1）：15.
【关键词】 铜绿假单胞菌；整合子；多重耐药
随着抗生素的广泛使用和不合理使用，细菌的耐药性问题日益严重。铜绿假单胞菌是引起医院感染重要的条件致病菌，对严重基础性疾病和免疫缺陷的住院患者常导致侵袭性感染，会对患者的生命产生严重威胁。铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，面对不同的抗生素耐药，会使得感染源频繁发生，更有可能会引起部分铜绿假单胞菌的流行，变成难以解决的医学难题，分析细菌整合子的耐药基因的类别和表达，能够帮助对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解，给临床治疗提供有效的参考。本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 2012年3月——2012年10月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自ICU病房（53株）、呼吸科病房（49株）、普外科病房（28株）、泌尿科病房（16株）和内分泌病房（12株）。菌株分别分离自痰标本（68株）、脓汁（42株）、咽拭子（18株）、尿标本（12株）、伤口分泌物（10株）和血液（8株）。标准质控菌株为铜绿假单胞菌（ATCC27853）。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。
1.1.2 鉴定卡片 全自动微生物分析仪（VITEK-AMS）采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司，GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物。
1.1.3 PCR试剂 TaqDNA聚合酶，4种dNTP混合液，DNA分子标准参照物购自Takara公司；琼脂糖，溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。
1.1.4 主要仪器 VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司；PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf公司；PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品；DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株鉴定 所有菌株都用VITEK AMS 分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEK AMS规定的方法进行。
1.2.2 加热裂解法制备DNA模板 用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。
1.2.3 筛选1型整合子阳性菌株 用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为：DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟；94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分钟，循环35次；最后72℃延伸10分钟。
1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果
1.2.5 统计学处理 采用χ2检验，P<0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。
2 结 果
2.1 1类整合子基因检测结果 全部158株铜绿假单胞菌的DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱，见下图。
2.2 1类整合子阳性菌株与耐药性的关系 对比1类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，见表1。
1类整合子阴性菌株对11种抗菌药物完全敏感率为54.4%（86/158）。1类整合子阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药。耐药率最高的是复方新诺明（100%）其次为氨苄青霉素（90.5%）和庆大霉素（85.7%），丁胺卡那也表现出较高的耐药率（76.7%）。1类整合子阳性菌株对6种药物的耐药率显著高于阴性菌株，P<0.05。
2.3 1类整合子与多重耐药率的相关性 多重耐药率（耐4种以上抗生素）为62.0%（98/158），其中1类整合子阳性菌株多重耐药率占85.7%（36/42），阴性菌株多重耐药率为20.7%（24/116）。1类整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株，差异有统计学意义（χ2=55.31，P<0.01）。
3 讨 论 整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可以捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药[1]给临床治疗带来极大的困难。整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌耐药性的发展，是细菌多重耐药性强化的根本因素。结合整合酶的特点，将其分成六种[2]分析临床的菌株最常见的是1类合子。这种整合子的基本结构包括三方面内容，两端是规整的序列，一般叫做5’CS和3’CS，5’CS和3’CS之间为可变区，可变区包括单个或多个外部的基因构成[3]。通过整合酶的作用，结合主要系统内容融合外部耐药金银，使得耐药基因不断发展，提升器细菌本书呢的耐药和多重耐药性。目前在1类整合子中发现的基因盒已超过80种，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床抗生素耐药。
我院铜绿假单胞菌占致病菌分离菌的第一位，高达两成以上，它是引发下呼吸道感染以及伤口感染的重要原因，另外其对多种抗生素具有耐药性，经常会引发感染，更可能会形成局部铜绿假单胞菌，是目前临床医学的重要研究内容，这和铜绿假单胞菌复杂的耐药机制有很大的关系[1]。研究细菌整合子的耐药基因种类和表达，可以有效提升对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解。
铜绿假单胞菌作为医院感染的重要的条件致病菌，在长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后的病人易导致本菌感染，该菌常常具有多重耐药的特点，因此其所造成的感染难以治愈，病死率高。而近年证实整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药的主要原因之一[4]。
本研究显示，铜绿假单胞菌在呼吸道的感染占首位为54.5%（86/158），这与大多数文献的报导相符合[5]究其原因，可能与铜绿假单胞菌容易定植于呼吸道，且由于气管插管、流感病毒感染及其他各种炎症等因素损害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，细菌易于移生、粘附有关。伤口创面也较易受其侵害，检出率32.9%（52/158），居第二位，与其存在广泛及医院环境的隔离消毒程度关系颇大。实验证明，我院患者分离的铜绿假单胞菌对多种抗生素出现高耐药，尤其是表现出对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、单环β-内酰胺类以及磺胺类等的多重耐药性，更是不容忽视。
由于抗生素使用量和种类日趋增多，使细菌生存面临更大的抗生素选择压力。本次研究客观反映了我院铜绿假单胞菌的整合子携带情况，分析本次结果发现在158株铜绿假单胞菌中检出42株整合子阳性，检出率为26.6%，与其他报道铜绿假单胞菌整合子检出率不完全相同[6]，这可能是由于地域的不同所造成的，也可能与菌株的来源有关。整合子阳性的细菌表现出多重耐药性比整合子阴性菌高，证实了整合子介导了多重耐药性产生。但由于铜绿假单胞菌耐药机制较为复杂，耐药性还与抗菌药物作用的靶位改变、OprD蛋白缺失引起的菌膜通透性下降、菌体细胞膜上主动外排泵系统的上调还有形成β-内酰胺酶等相关机制有关系，所以要强化对铜绿假单胞菌的耐药机制的研究，要加强这部分的分析，通过强有力的手段控制它的耐药性发展。抗生素应用的范围越大，其使用心得耐药基因的优势菌就变得更多，就会使得携带耐药基因菌群的数量增加，使得1类整合子多重耐药细菌提供了选择性压力，会增加它的耐药种类，使得其传播速度得到提高。所以，该耐药机制引起的细菌耐药应该引起临床的足够重视，加大监测力度，预防医院感染的发生。
参考文献
[1] Toleman MA，Bennett PM，Walsh TR.ISCR etements：novel gene —capturing systems of the 21st century [J].Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（2）：296-316.
[2] Van EssenZandbergen A，Smith H，Veldmanl K，et al.Occurrence and characteristics of class 1，2 and 3 integrons in Escherichia coli，Salmonella and Campylobacter spp.in the Netherlands[J].J Antimicrob Chemother，2007，59：746-758.
[3] Mazel D.Integrons：agents of bacterial evolution [J].Nat Rev Microbiol，2006，4（8）：608-620.
[4] 廖如燕，陈珍玲，周霓，等.广东地区医院分离铜绿假单胞菌整合子及其攜带耐药基因的研究[J].中国消毒学杂志，2012，29（3）：183-187.
[5] 王志锐，李力，张坚磊，等.耐药铜绿假单胞菌携带的整合子及其耐药基因盒检测分析[J].中华检验医学杂志，2007，30（7）：802-803.
[6] 杨维青，石磊，尹晓琳，等.不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布[J].中国抗生素杂志，2006，31（1）：15.