PCR—核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分

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  摘要 [目的]提高动物源性成分检测效率,建立PCR-核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列,设计并标记引物;建立并优化PCR反应体系;利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明,PCR-核酸试纸条特异性高;绝对灵敏度为0.001 3ng/μL,混合样品,实际灵敏度为0.01%;加工处理样品,实际灵敏度为0.1%;最低检测限检出率为100%,稳定性良好。[结论]综上,PCR-核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度,又具有免疫学检测的特异性好的特点,同时操作简便的快速检测方法。
  关键词 核酸试纸条;动物源;食品安全
  中图分类号 TS207文献标识码 A文章编号 0517-6611(2016)20-083-03
  Abstract [Objective] In order to improve the efficiency of detecting ingredients of animal origin, the PCR - nucleic acid strip rapid detection technology system was established. [Method] In view of the species specific DNA sequences, primers were designed and marked; the PCR reaction system was established and optimized; the results were interpretated by the nucleic acid strip. [Result] The results showed that: the PCR- nucleic acid strip is high specificity; absolute sensitivity is 0.001 3 ng/μL; the actual sensitivity in mixed samples is 0.01%; the actual sensitivity in processing sample is 0.1%; the detection rate of minimum detection limit is 100%, the stability is good. [Conclusion] To sum up, the high sensitivity as PCR and high specfticity as immunology made the PCR- chromatography strip valuable for the rapid detection method.
  Key words Nucleic acid test paper; Animal origin; Food safety
  近年来,我国食品市场上一些不法分子为牟取暴利,在肉制品中搀杂使假、以假乱真。如2013年初,欧洲的“马肉风波”愈演愈烈,使得消费者“闻马色变”;近日欧美的“鱼肉风波”又再一次拉响了食品安全的警钟。
  动物源性食品及饲料的安全隐患直接关系到人类的安危,引起了各国政府和消费者对食品及饲料的安全性高度关注。因此,迫切需要建立食品及饲料中动物源性成分快速、准确、简便的检测鉴定方法,对食品及饲料中动物源性成分检测鉴定,有利于保护消费者健康,维护消费者利益,防止疫情疫病的传入传出,并避免假冒伪劣食品的出现。
  在动物源性成分检测方法中,基于核酸的分子生物学技术应用最为广泛,其中包括DNA测序、物种特异性PCR、实时定量PCR、RFLP等。PCR(聚合酶连反应)技术最早由Mullis等于1986年提出[1],因其特异性强、敏感度高、操作简便等优点,目前已被广泛用于各种动物源性成分[2-6]和其他过敏原及细菌[7-8]的快速检测。但同时PCR技术有一定的局限性,技术含量高,电泳检测耗时、程序复杂、EB染色时对环境有危害、依赖于昂贵的设备等。因此,要在大量的日常检测和快速筛查工作中构建食品安全保障体系,就需要开发一些不依赖贵重仪器设备的、快速准确的现场检测试剂和简单、方便、经济的检测技术。
  胶体金免疫层析法是一种快速的免疫学测定方法[9],具有简便、快速、准确等优点[10],在甲型H1N1病毒[11-12]、外源基因EPSPS[13]的检测等方面也有应用,在动物源性食品检测中的应用主要在于质量控制[14]、病原微生物检测[15]领域等。PCR-核酸试纸条则是利用PCR与通用免疫金标层析试纸条相结合的方法重新设计、标记引物,优化反应体系,以通用免疫金标层析试纸条为载体进行结果判读。笔者以鸽子肉为试验材料,建立一种PCR-核酸试纸条快速检测方法,充分利用PCR检测的高灵敏度、特异性强的特点,又结合了免疫金标试纸条简便、快捷、成本低的优势,实现对PCR结合试纸条检测,使检测结果可视化,直观简便,易于操作,对加工动物源性食品的质量进行把关,有利于维护消费者利益,保障人民生命安全,为打击违法行为提供技术支撑。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  市场购买鸽子肉1 kg,鸡、鸭、猪肉各1 kg,牛肉5 kg,采集肌肉组织。天根动物组织基因组DNA提取试剂盒;TaKaRa Ex Taq Hs DNA聚合酶(5 U/μL);TaKaRa dNTP Mixture(2.5 mmol/L);10X Ex Taq Buffer TaKaRa;Agilent DNA Chips(5067-1504)、Agilent DNA 1000 Markers、Agilent DNA 1000 Ladder,安捷伦科技(中国)有限公司;PCR-核酸试纸条及展开液,天津出入境检验检疫局。   1.2 方法
  1.2.1 检测原理。
  该研究标准采用PCR结合通用免疫金标层析试纸条的方法:根据物种特异性基因设计特异性引物,一条引物的5′端标记异硫氰酸荧光素(FITC),另一条引物的5′端标记生物素(biotin)。PCR扩增产物经过试纸条检测,试纸条质控线变红色,且检测线变红色,PCR扩增产物为阳性;试纸条质控线变红色,检测线不变色,PCR扩增产物为阴性。PCR阳性产物经测序进行确证。
  1.2.2 DNA提取。采用天根动物组织基因组DNA提取试剂盒进行提取。
  1.2.3 引物设计。
  经反复检测验证,确定鸽子源性成分检测靶序列及特异性引物如下:
  1.2.4 PCR扩增体系的优化。
  对PCR-核酸试纸条反应体系进行优化,确定反应体系为:DNA模板1.0 μL,上、下游引物各0.8 μL,dNTP 2.0 μL,10X PCR buffer 2.0 μL,HS Taq DNA polymerase 0.2 μL,ddH2O 13.2 μL,总体积为20 μL。反应条件为:94 ℃ 预变性5 min;94 ℃ 变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环后进入72 ℃、5 min。
  1.2.5 PCR-核酸试纸条反应。
  取5 μL PCR产物点于核酸试纸条样品垫,用200 μL移液器吸取展开液,滴4~5滴进行检测,5 min后观察结果,在空白对照试纸条质控线变红色,检测线不变色;阳性对照试纸条质控线变红色,检测线变红色的条件下:
  试纸条质控线变红色,且检测线变红色,PCR扩增产物为阳性,初筛结果检出鹧鸪成分;试纸条质控线变红色,检测线不变色,PCR扩增产物为阴性,未检出鹧鸪成分。同时进行凝胶电泳检测。
  2 结果与分析
  2.1 引物特异性试验
  以上述PCR-核酸试纸条反应体系及程序进行特异性检测,分别以取自鸽子的鸽子肉为阳性对照品,选择动物样品牛、羊、马、猪、鼠、兔、狗、猫、鸡、鸭、鹅及植物样品胡萝卜、洋葱等的基因组DNA为阴性对照,以无菌水为空白对照。结果显示,特异性较好,能对鸽子成分样品进行有效扩增,电泳及试纸条结果见图1。
  2.2 灵敏度检测
  2.2.1 PCR-核酸试纸条方法的绝对灵敏度试验。
  将鸽子基因组DNA 5倍倍比稀释,使其浓度为100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.006 4、0.001 3、0.000 3、0.000 1、0.000 02 ng/μL。结果显示,电泳方法在浓度为0.16ng/μL时有明亮条带,在浓度0.032 ng/μL时条带不清晰。PCR-核酸试纸条在浓度为0.001 3ng/μL时检测线显示红色,为阳性,在浓度为0.000 3ng/μL时检测线不显色,为阴性。结果表明,在绝对灵敏度方面,PCR-层析试纸条方法具有较高的灵敏度,比电泳方法高100倍。电泳及试纸条结果见图2。
  2.2.2 鸽子肉和鸽子肉DNA实际灵敏度检测。
  为了验证该方法对鸽子肉及鸽子肉DNA检测的实际灵敏度,对混合DNA样品和混合肉样品分别进行了检测。以鸽子肉为阳性样品,以牛肉模拟掺假样品,将鸽子肉与牛肉切片,60 ℃烘干,研磨成粉末,过18目筛筛取粉末,制备鸽子肉-牛肉的混合模拟样品,以鸽子肉肉粉的质量百分比(W/W)为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%比例混匀,提取基因组DNA,DNA浓度调至5 ng/μL。
  将浓度均为5 ng/μL的鸽子肉DNA与牛肉DNA混合,使混合物中鸽子肉DNA含量依次为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%。对模拟样品进行灵敏度检测,试验所用样品均设置了3次重复。PCR-试纸条检测结果表明,当鸽子肉在混合肉品中的比例为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%时,试纸条质控线和检测线均能显示红色条带,最低检测限均可达0.01%。电泳及试纸条结果见图3。
  2.2.3 加工处理样品灵敏度检测。
  将鸽子肉和牛肉样品分别用100 ℃高温2 h,油煎5 min,以未处理的样品作对照。结果发现,经高温和油煎2种方式加工处理后,检测最低检测限降低为0.10%。电泳及试纸条检测结果如图4、5所示。
  2.3 最低检测限稳定性检测
  用PCR-核酸试纸条法,将未处理的0.01%鸽子肉和牛肉混合样品及高温和油煎2种加工处理的0.1% 鸽子肉-牛肉样品的DNA重复进行低限稳定性检测,最低浓度样品重复检测20次,分别以对应处理方式的鸽子肉 、牛肉的DNA为阳性对照和阴性对照。结果发现,未经任何处理的0.01%鸽子肉-牛肉样品及高温和油煎2种不同方式加工处理的0.1% 鸽子肉-牛肉样品,20次试纸条检测检测线均变红,即检测低限的稳定性较好,检出率为100%。详见表1。
  3 结论与讨论
  该研究以鸽子肉为例,建立了PCR-核酸试纸条方法用来检测动物源性成分,同时用电泳方法进行比较,对2种方法的特异性、绝对灵敏度、实际灵敏度、最低检测限稳定性结果进行了比较。结果表明,2种方法的特异性良好,灵敏度方面PCR-核酸试纸条方法优于普通PCR方法,并且检测限更低,稳定性好。
  由试验结果可以看出,PCR-核酸试纸条呈现出良好的特异性;绝对灵敏度方面,电泳方法的检测限为0.16 ng/μL,PCR-层析试纸条为0.001 3 ng/μL,高于电泳100倍;实际灵敏度方面,普通PCR为1%,PCR-层析试纸条为0.01%,比电泳检测灵敏度高出100倍;检测低限为0.01%~0.10%。方法特异性强,稳定性好,适用于动物源性成分检测。   PCR-核酸试纸条技术是通过核酸引物或探针两端修饰相应标记物(如生物素、荧光素),同时在试纸条上相应位置标记对应抗体,实现核酸产物的试纸条检测。目前此技术已经在转基因黑曲霉[16]、艾滋病毒(HIV)[17]、丙型肝炎病毒[18]、线虫[19]、HBV DNA[20]中得到应用,在灵敏度方面均优于电泳方法,检测时间大大缩短,并且对环境友好,处理简单。
  灵敏度、准确性、特异性、通量、便捷性等都是衡量检测方法优劣的重要指标。我国现有的社会经济条件下,需要在大量的日常检测和快速筛查工作中构建食品安全保障体系,就需要开发一些不依赖贵重仪器设备的、快速准确的现场检测试剂和简单、方便、经济的检测技术。PCR-核酸试纸条技术使得有关的检测工作能在口岸快速筛查、基层或偏远经济不发达地区顺利开展,为进行分子生物学检测广泛的应用和推广提供一种新的安全、便捷手段,及时发现问题、解决问题提供技术支持。
  参考文献
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