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关键词：葡萄糖酸;2-酮基葡萄糖酸;木糖酸;磷酸钙;磷酸镁;解磷机理
磷是植物生长中不可或缺的三大元素之一[1]，是植物体内结构化合物的重要组成元素，可参与细胞的物质运输、信息交流和能量交换等生命活动，如果在植物生长过程中缺少磷元素，会影响细胞的分裂增殖和其他生命活动[2]。磷具有极强的化学反应性，使得土壤中的磷元素多以难溶性磷酸盐的形式存在，导致磷在农业生产中普遍缺乏[3]。施用可溶性磷酸盐是为植物提供磷的主要途径，但是由于磷酸根易与土壤中的钙、镁等其他金属离子形成难溶性化合物而固定在土壤中，降低了磷的使用效率。据统计，约有80%的磷肥最终转化为难溶性化合物而无法被植物吸收利用[4]。因此，减少磷的沉淀、增加土壤中有效磷的含量，成为农业生产中长期关注的研究热点。
研究发现，土壤中存在的细菌[5]、真菌[6]、放线菌[7]等多种微生物的代谢物可以将难溶性磷酸盐转化为可溶性形态。关于微生物的溶磷机制，主要有氢质子交换[8]、螯合理论[9]、磷酸酶蛋白理论[10]和氧化还原理论[11]。合成有机酸是微生物溶磷的重要化学基础，而具有合成葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸能力的微生物通常具有优良的溶磷效果[12-15]。利用微生物溶解土壤中的难溶性磷酸盐不仅绿色可持续，而且成本较低，具有较高的应用价值。克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，广泛存在于水、植物、土壤及动物中，是重要的根际微生物[16-18]。该菌种生长繁殖速度快、代谢旺盛、代谢产物丰富，是一种重要的工业微生物[19]。克雷伯氏肺炎杆菌等微生物中存在1条直接氧化葡萄糖的途径，该途径位于细胞的周质空间，葡萄糖经过氧化形成葡萄糖酸，葡萄糖酸进一步氧化形成2-酮基葡萄糖酸。在酸性条件下培养克雷伯氏肺炎杆菌，发现其发酵液中积累了大量2-酮基葡萄糖酸[20]。此外研究发现，以葡萄糖酸脱氢酶失活突变株为生产菌株可以合成大量葡萄糖酸[21];以木糖为底物可以合成相应的木糖酸[22];以生物质水解液等为底物，可以获得葡萄糖酸和木糖酸的混合物。
不同于利用微生物进行解磷效果研究的工作[23-25]，本研究利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵法制备糖酸类化合物，对糖酸类化合物与钙离子、镁离子形成的配合物进行研究，根据图 1的解磷机制（糖酸根离子与钙离子形成配合物，减少了游離钙离子，进而使磷酸钙溶解平衡向右移动，使磷酸根的溶解度增大），测定配合物的稳定常数，以定量确定这些糖酸类化合物通过与金属离子形成配合物进而溶解磷的机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
土壤取自上海市浦东新区海科路川洋河畔，除去表层垂直厚度约为5 cm的土壤，并除去植物残根、石块等杂物，用洁净的塑料袋储存。2-酮基葡萄糖酸钠和木糖酸钠由笔者所在实验室发酵制备;其他化学试剂均为分析纯商业产品。
1.2 主要仪器
pH电位计，德国赛多利斯;小型高速离心机、高速离心机，德国Eppendorf;ZWY-2102C恒温振荡摇床，上海智城分析仪器制造有限公司;PXS-270型离子计、钙离子电极，雷磁上海仪电科学仪器股份有限公司;ZDP-A2160A全自动新型电热培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司;Biostat A Plus发酵罐，德国赛多利斯。
1.3 糖酸钠盐的制备
以笔者所在实验室已经构建的菌株K. pneumoniae-ΔbubA为生产菌株，采用5 L发酵罐，以两段法发酵制备2-酮基葡萄糖酸[26]。在第1阶段，搅拌桨转速为500 r/min，发酵温度为37.0 ℃，通气量为0.8 N·m3/h，用30%质量分数的NaOH调节发酵液的pH值为7.00。待菌体生长到D600 nm约为6.0时，进入第2阶段的发酵，将搅拌桨转速提升为800 r/min，控制发酵液的pH值为5.00。在发酵过程中通过高效液相色谱及时检测底物葡萄糖的质量浓度，当其质量浓度为20～30 g/L时，补加底物葡萄糖。
2-酮基葡萄糖酸发酵培养基配方如下：100 g/L 葡萄糖，4 g/L玉米浆，5 g/L硫酸铵，5 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钙，3 g/L三水合乙酸钠，04 g/L氯化钾，0.1 g/L七水硫酸镁，0.02 g/L七水硫酸亚铁，0.01 g/L一水合硫酸锰。
从发酵液中提取2-酮基葡萄糖酸钠，按照图2的流程进行分离提纯以获取纯度较高的2-酮基葡萄糖酸钠晶体。以木糖为底物替代葡萄糖，采用与2-酮基葡萄糖酸钠相同的方法制备木糖酸钠。
1.4 糖酸根与钙、镁离子配合物稳定常数的测定
配制CaCl2浓度梯度为5.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-3、5.0×10-4、2.0×10-5 mol/L的标准溶液，分别向其中滴加1～2滴饱和硝酸钾溶液以维持溶液的离子强度，用离子电极测得pX2 （X2 表示二价阳离子），根据相应的pX2 绘制钙离子浓度标准曲线，用相同的方法绘制镁离子浓度标准曲线。在250 mL锥形瓶中加入5 mL浓度为0.1 mol/L的CaCl2溶液，然后向其中加入45 mL去离子水，振荡混匀。用50 mL滴定管向混合溶液中滴加0.1 mol/L葡萄糖酸钠溶液，用电极测定并记录溶液的pX2 变化，根据标准曲线计算溶液中的游离钙离子浓度。2-酮基葡萄糖酸根、木糖酸根与钙离子、镁离子结合的研究方法同上。
根据Nelson等的报道[27-28]，使糖酸根与钙离子按1 ∶ 1结合形成配合物，钙离子与糖酸根形成配合物的稳定常数K的计算公式：
镁离子与糖酸根按照1 ∶ 1的物质的量之比结合，其平衡常数K的计算表达式同式（1）。
1.5 用糖酸钠溶液溶解磷酸钙和磷酸镁
准确称取于105.0 ℃干燥3 h的磷酸钙固体粉末 0.50 g、葡萄糖酸钠固体1.50 g（4.84 mmol），用去离子水溶解后转移到100 mL容量瓶中定容，再将溶液转移至250 mL锥形瓶中，用橡胶塞封口，配制成葡萄糖酸根与总钙物质的量之比为1 ∶ 1的体系。用同样方法配制葡萄糖酸根与总钙物质的量比分别为0 ∶ 1、2 ∶ 1、4 ∶ 1、6 ∶ 1、8 ∶ 1、10 ∶ 1的体系。于25.0 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中进行溶解，每天取样，将样品于10 000 r/min离心10 min，取上清液，使用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，采用钼蓝比色法测定滤液中的磷酸根含量[29]。用2-酮基葡萄糖酸钠和木糖酸钠溶液溶解磷酸钙以及用糖酸钠溶液溶解磷酸镁采用与上述相同的方法。 1.6 用糖酸钠溶液溶解土壤中的磷元素
（1）土壤中有效磷浓度的测定。称取10.00 g风干土壤于50 mL离心管中，然后加入30 mL水，盖紧盖子，漩涡振荡1～2 min，静置30 min，用5 mol/L NaHCO3溶液浸提土壤中的有效磷并测定其有效磷浓度[30]。（2）土壤中总磷浓度的测定。土壤中含磷矿物质和有机磷化合物在高温下与高氯酸作用，全部转化为正磷酸盐。采用钼蓝比色法测定其中的磷酸根浓度，即土壤中的总磷浓度。称取1.00 g土壤样品置于消解管中，加入少量水润湿，再加入 8 mL 浓硫酸过夜浸泡处理;然后向其中加入 0.5 mL 高氯酸，用红外消解炉于120 ℃消解 120 min 后静置至室温，向其中多次少量加入去离子水，并转移至 100 mL 容量瓶内，振荡混匀，待其冷却至室温后再定容。采用钼蓝比色法测定所得溶液中的磷酸根浓度，即为土壤样品中的全磷浓度[31]。（3）糖酸解磷试验。分别称取6份土壤样品于烧杯中，每份10.00 g，加入0.05 mol/L葡萄糖酸钠溶液，使溶液总体积为100 mL，得到的葡萄糖酸钠溶液终浓度分别为1×10-3、2×10-3、4×10-3、6×10-3、8×10-3、1×10-2 mol/L，在25 ℃、200 r/min 條件下振荡，每天取样并测定溶液中的磷酸根浓度。用2-酮基葡萄糖酸钠和木糖酸钠溶解土壤中难溶性磷酸盐的方法与用葡萄糖酸钠溶解土壤中难溶性磷酸盐的方法相同。
2 结果与分析
2.1 糖酸钠盐的制备以及分离纯化
按照“1.3”节中的操作步骤，利用葡萄糖制备 2-酮基葡萄糖酸钠。经过42 h的发酵，底物葡萄糖完全被消耗，发酵液中产生了166.0 g/L 2-酮基葡萄糖酸钠，底物转化率为0.91 g/g。
以木糖为底物时，经过120 h的发酵，产生的木糖酸钠质量浓度为207.8 g/L，底物转化率为 0.82 g/g。将发酵液按照图2中糖酸钠分离提纯的步骤进行分离纯化，根据液相检测结果，每步收集的糖酸钠质量和回收率见表1。2-酮基葡萄糖酸钠在脱色步骤中损失较多，回收率为93.2%;其他步骤中产品的回收率都较高，重结晶后晶体的纯度为98.9%。此外，木糖酸钠脱色后的回收率为934%，重结晶后晶体的纯度为99.0%。
2.2 基于离子电极法测定钙离子和镁离子的标准曲线
用离子电极法测得钙离子和镁离子的标准溶液;测得的pX2 与对应离子浓度的标准曲线见图3，其中钙离子浓度（y1）与pX2 （x1）之间的关系式：y1=-0.011 2x1 0.098 4，r2=0.997 2;镁离子浓度（y2）与pX2 （x2）之间的关系式：y2=-0.011 3x2 0070 4，r2=0.998 7。
2.3 糖酸根与钙离子、镁离子的结合及其稳定常数的测定
按照“1.4节”中所列方法，向氯化钙、氯化镁溶液中滴加糖酸钠溶液，用离子电极测定离子浓度（图4-a、图4-b）。根据式（1），计算得到糖酸根与钙离子、镁离子形成的配合物的稳定常数。
由图4-c可知，钙离子与葡萄糖酸根形成的配合物的稳定平衡常数为58.8～79.7 L/mol，平均为66.1 L/mol;钙离子与2-酮基葡萄糖酸根形成的配合物的稳定常数为93.6～129.8 L/mol，平均为 109.7 L/mol;钙离子与木糖酸根结合的平衡常数为12.7～31.3 L/mol，平均为19.2 L/mol。总体看出，糖酸根与钙离子形成的配合物的稳定性排序如下：2-酮基葡萄糖酸
磷是植物生长中不可或缺的三大元素之一[1]，是植物体内结构化合物的重要组成元素，可参与细胞的物质运输、信息交流和能量交换等生命活动，如果在植物生长过程中缺少磷元素，会影响细胞的分裂增殖和其他生命活动[2]。磷具有极强的化学反应性，使得土壤中的磷元素多以难溶性磷酸盐的形式存在，导致磷在农业生产中普遍缺乏[3]。施用可溶性磷酸盐是为植物提供磷的主要途径，但是由于磷酸根易与土壤中的钙、镁等其他金属离子形成难溶性化合物而固定在土壤中，降低了磷的使用效率。据统计，约有80%的磷肥最终转化为难溶性化合物而无法被植物吸收利用[4]。因此，减少磷的沉淀、增加土壤中有效磷的含量，成为农业生产中长期关注的研究热点。
研究发现，土壤中存在的细菌[5]、真菌[6]、放线菌[7]等多种微生物的代谢物可以将难溶性磷酸盐转化为可溶性形态。关于微生物的溶磷机制，主要有氢质子交换[8]、螯合理论[9]、磷酸酶蛋白理论[10]和氧化还原理论[11]。合成有机酸是微生物溶磷的重要化学基础，而具有合成葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸能力的微生物通常具有优良的溶磷效果[12-15]。利用微生物溶解土壤中的难溶性磷酸盐不仅绿色可持续，而且成本较低，具有较高的应用价值。克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，广泛存在于水、植物、土壤及动物中，是重要的根际微生物[16-18]。该菌种生长繁殖速度快、代谢旺盛、代谢产物丰富，是一种重要的工业微生物[19]。克雷伯氏肺炎杆菌等微生物中存在1条直接氧化葡萄糖的途径，该途径位于细胞的周质空间，葡萄糖经过氧化形成葡萄糖酸，葡萄糖酸进一步氧化形成2-酮基葡萄糖酸。在酸性条件下培养克雷伯氏肺炎杆菌，发现其发酵液中积累了大量2-酮基葡萄糖酸[20]。此外研究发现，以葡萄糖酸脱氢酶失活突变株为生产菌株可以合成大量葡萄糖酸[21];以木糖为底物可以合成相应的木糖酸[22];以生物质水解液等为底物，可以获得葡萄糖酸和木糖酸的混合物。
不同于利用微生物进行解磷效果研究的工作[23-25]，本研究利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵法制备糖酸类化合物，对糖酸类化合物与钙离子、镁离子形成的配合物进行研究，根据图 1的解磷机制（糖酸根离子与钙离子形成配合物，减少了游離钙离子，进而使磷酸钙溶解平衡向右移动，使磷酸根的溶解度增大），测定配合物的稳定常数，以定量确定这些糖酸类化合物通过与金属离子形成配合物进而溶解磷的机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
土壤取自上海市浦东新区海科路川洋河畔，除去表层垂直厚度约为5 cm的土壤，并除去植物残根、石块等杂物，用洁净的塑料袋储存。2-酮基葡萄糖酸钠和木糖酸钠由笔者所在实验室发酵制备;其他化学试剂均为分析纯商业产品。
1.2 主要仪器
pH电位计，德国赛多利斯;小型高速离心机、高速离心机，德国Eppendorf;ZWY-2102C恒温振荡摇床，上海智城分析仪器制造有限公司;PXS-270型离子计、钙离子电极，雷磁上海仪电科学仪器股份有限公司;ZDP-A2160A全自动新型电热培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司;Biostat A Plus发酵罐，德国赛多利斯。
1.3 糖酸钠盐的制备
以笔者所在实验室已经构建的菌株K. pneumoniae-ΔbubA为生产菌株，采用5 L发酵罐，以两段法发酵制备2-酮基葡萄糖酸[26]。在第1阶段，搅拌桨转速为500 r/min，发酵温度为37.0 ℃，通气量为0.8 N·m3/h，用30%质量分数的NaOH调节发酵液的pH值为7.00。待菌体生长到D600 nm约为6.0时，进入第2阶段的发酵，将搅拌桨转速提升为800 r/min，控制发酵液的pH值为5.00。在发酵过程中通过高效液相色谱及时检测底物葡萄糖的质量浓度，当其质量浓度为20～30 g/L时，补加底物葡萄糖。
2-酮基葡萄糖酸发酵培养基配方如下：100 g/L 葡萄糖，4 g/L玉米浆，5 g/L硫酸铵，5 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钙，3 g/L三水合乙酸钠，04 g/L氯化钾，0.1 g/L七水硫酸镁，0.02 g/L七水硫酸亚铁，0.01 g/L一水合硫酸锰。
从发酵液中提取2-酮基葡萄糖酸钠，按照图2的流程进行分离提纯以获取纯度较高的2-酮基葡萄糖酸钠晶体。以木糖为底物替代葡萄糖，采用与2-酮基葡萄糖酸钠相同的方法制备木糖酸钠。
1.4 糖酸根与钙、镁离子配合物稳定常数的测定
配制CaCl2浓度梯度为5.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-3、5.0×10-4、2.0×10-5 mol/L的标准溶液，分别向其中滴加1～2滴饱和硝酸钾溶液以维持溶液的离子强度，用离子电极测得pX2 （X2 表示二价阳离子），根据相应的pX2 绘制钙离子浓度标准曲线，用相同的方法绘制镁离子浓度标准曲线。在250 mL锥形瓶中加入5 mL浓度为0.1 mol/L的CaCl2溶液，然后向其中加入45 mL去离子水，振荡混匀。用50 mL滴定管向混合溶液中滴加0.1 mol/L葡萄糖酸钠溶液，用电极测定并记录溶液的pX2 变化，根据标准曲线计算溶液中的游离钙离子浓度。2-酮基葡萄糖酸根、木糖酸根与钙离子、镁离子结合的研究方法同上。
根据Nelson等的报道[27-28]，使糖酸根与钙离子按1 ∶ 1结合形成配合物，钙离子与糖酸根形成配合物的稳定常数K的计算公式：
镁离子与糖酸根按照1 ∶ 1的物质的量之比结合，其平衡常数K的计算表达式同式（1）。
1.5 用糖酸钠溶液溶解磷酸钙和磷酸镁
准确称取于105.0 ℃干燥3 h的磷酸钙固体粉末 0.50 g、葡萄糖酸钠固体1.50 g（4.84 mmol），用去离子水溶解后转移到100 mL容量瓶中定容，再将溶液转移至250 mL锥形瓶中，用橡胶塞封口，配制成葡萄糖酸根与总钙物质的量之比为1 ∶ 1的体系。用同样方法配制葡萄糖酸根与总钙物质的量比分别为0 ∶ 1、2 ∶ 1、4 ∶ 1、6 ∶ 1、8 ∶ 1、10 ∶ 1的体系。于25.0 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中进行溶解，每天取样，将样品于10 000 r/min离心10 min，取上清液，使用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，采用钼蓝比色法测定滤液中的磷酸根含量[29]。用2-酮基葡萄糖酸钠和木糖酸钠溶液溶解磷酸钙以及用糖酸钠溶液溶解磷酸镁采用与上述相同的方法。 1.6 用糖酸钠溶液溶解土壤中的磷元素
（1）土壤中有效磷浓度的测定。称取10.00 g风干土壤于50 mL离心管中，然后加入30 mL水，盖紧盖子，漩涡振荡1～2 min，静置30 min，用5 mol/L NaHCO3溶液浸提土壤中的有效磷并测定其有效磷浓度[30]。（2）土壤中总磷浓度的测定。土壤中含磷矿物质和有机磷化合物在高温下与高氯酸作用，全部转化为正磷酸盐。采用钼蓝比色法测定其中的磷酸根浓度，即土壤中的总磷浓度。称取1.00 g土壤样品置于消解管中，加入少量水润湿，再加入 8 mL 浓硫酸过夜浸泡处理;然后向其中加入 0.5 mL 高氯酸，用红外消解炉于120 ℃消解 120 min 后静置至室温，向其中多次少量加入去离子水，并转移至 100 mL 容量瓶内，振荡混匀，待其冷却至室温后再定容。采用钼蓝比色法测定所得溶液中的磷酸根浓度，即为土壤样品中的全磷浓度[31]。（3）糖酸解磷试验。分别称取6份土壤样品于烧杯中，每份10.00 g，加入0.05 mol/L葡萄糖酸钠溶液，使溶液总体积为100 mL，得到的葡萄糖酸钠溶液终浓度分别为1×10-3、2×10-3、4×10-3、6×10-3、8×10-3、1×10-2 mol/L，在25 ℃、200 r/min 條件下振荡，每天取样并测定溶液中的磷酸根浓度。用2-酮基葡萄糖酸钠和木糖酸钠溶解土壤中难溶性磷酸盐的方法与用葡萄糖酸钠溶解土壤中难溶性磷酸盐的方法相同。
2 结果与分析
2.1 糖酸钠盐的制备以及分离纯化
按照“1.3”节中的操作步骤，利用葡萄糖制备 2-酮基葡萄糖酸钠。经过42 h的发酵，底物葡萄糖完全被消耗，发酵液中产生了166.0 g/L 2-酮基葡萄糖酸钠，底物转化率为0.91 g/g。
以木糖为底物时，经过120 h的发酵，产生的木糖酸钠质量浓度为207.8 g/L，底物转化率为 0.82 g/g。将发酵液按照图2中糖酸钠分离提纯的步骤进行分离纯化，根据液相检测结果，每步收集的糖酸钠质量和回收率见表1。2-酮基葡萄糖酸钠在脱色步骤中损失较多，回收率为93.2%;其他步骤中产品的回收率都较高，重结晶后晶体的纯度为98.9%。此外，木糖酸钠脱色后的回收率为934%，重结晶后晶体的纯度为99.0%。
2.2 基于离子电极法测定钙离子和镁离子的标准曲线
用离子电极法测得钙离子和镁离子的标准溶液;测得的pX2 与对应离子浓度的标准曲线见图3，其中钙离子浓度（y1）与pX2 （x1）之间的关系式：y1=-0.011 2x1 0.098 4，r2=0.997 2;镁离子浓度（y2）与pX2 （x2）之间的关系式：y2=-0.011 3x2 0070 4，r2=0.998 7。
2.3 糖酸根与钙离子、镁离子的结合及其稳定常数的测定
按照“1.4节”中所列方法，向氯化钙、氯化镁溶液中滴加糖酸钠溶液，用离子电极测定离子浓度（图4-a、图4-b）。根据式（1），计算得到糖酸根与钙离子、镁离子形成的配合物的稳定常数。
由图4-c可知，钙离子与葡萄糖酸根形成的配合物的稳定平衡常数为58.8～79.7 L/mol，平均为66.1 L/mol;钙离子与2-酮基葡萄糖酸根形成的配合物的稳定常数为93.6～129.8 L/mol，平均为 109.7 L/mol;钙离子与木糖酸根结合的平衡常数为12.7～31.3 L/mol，平均为19.2 L/mol。总体看出，糖酸根与钙离子形成的配合物的稳定性排序如下：2-酮基葡萄糖酸