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摘 要 核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）是被子植物分子系统发育研究中应用最广泛的分子标记。对收集的12份安徽地方特色桑种质资源提取总DNA，用PCR扩增方法进行测序分析；根据鲁桑基因序列，确定ITS序列范围，并进行序列比对；通过分析序列长度、G+C含量、变异位点及遗传分歧，探讨了安徽桑树种质材料间的亲缘关系，为更深入地研究桑属植物间的系统进化关系提供重要的参考资料。
关键词 桑树种质资源 ；ITS序列 ；进化分析
中图分类号 Q341
An Analysis on Genetic Relationship of Mulberry Germplasm Resources
Collected in Anhui Province Based on ITS Marker
WANG Yuting LI Ruixue SUN Fan WANG Wei WANG Taichu
（Sericultural Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230061）
Abstract Ribosome transcribed spacer（ITS）is the most widely used nuclear DNA sequence in molecular systems. The sequencing analysis was carried out by using the total DNA extraction and PCR amplification method. According to the sequence of Morus multicaulis gene，the ITS sequence range was determined and sequence alignment was performed. By analyzing the sequence length，G + C content and mutation loci and genetic divergence，the phylogenetic relationship between the collected mulberry germplasm in Anhui Province was discussed， which provided the basic reference for the further study of phylogenetic evolution between mulberry plants.
Key words Mulberry germplasm resources ；ITS marker ；phylogeny
桑属（Morus）为桑科的模式属，由Linne（1753）建立。桑树自然杂交普遍，形态学上种间界限相对模糊，属内种数、系统发育关系历来存在较大争议，因而在分子系统学中分类十分困难。从20世纪90 年代起，利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术围绕桑属植物的亲缘关系及系统进化等开展了一系列的研究[1-2]。进一步研究发现，核糖体内转录间隔区（intergenic transcribed spacer，ITS）序列是核基因组中进化较快的DNA片段，遗传信息位点十分丰富。
核糖体内转录间隔区（ITS）位于核糖体基因中18S、26S之间，是被5.8S分隔开的2段DNA片段[3]，分别为ITS1和ITS2（图1）。在被子植物基因组中，ITS序列是高度重复的串联序列，由于没有加入成熟核糖体，选择压力小，进化速度快，而其相对长度又具有保守性，适宜于对低分类群进行系统发育分析[4-6]，能够满足探讨属内种间和较近的族间、属间系统发育关系的要求[7-8]，已经逐渐成为被子植物亲缘关系及系统进化分析的重要工具[9]。向仲怀等[10]于1995年应用RAPD分子标记，最早开展对桑属分子系统学的研究，获得了桑属9个种的DNA多态性指纹图谱，得到了系统树状图。冯丽春等[11]也通过RAPD的方法，分析了桑属12个种、2个变种的遗传多样性。杨光偉等[12]采用显性分子标记RAPD技术，对桑属植物亲缘关系的分析结果认为川桑是最原始的。Zhao等[13]在对桑属进行分子系统学研究时将RAPD标记和微卫星DNA结合，分析结果表明蒙桑（M.mongolica）最原始。汪伟等[14]测定了亮氨酸转运RNA基因内含子序列（trnL），探讨了桑属的遗传距离，结果认为蒙桑是最原始的类群。史全良等[15]首次对蒙桑的ITS序列进行了报道。赵卫国等[16]收集了桑属9个种和3个变种，一共13份桑资源材料，将构树作为外类群，对ITS序列进行了测定，系统分析的结果认为，桑属为单系；蒙桑亲缘关系最远，在系统进化树中首先被分出，鬼桑和鸡桑聚为一枝，白桑进化程度最高。
本研究收集了12种安徽特色桑品种资源（表1），对实验材料的ITS序列进行了遗传变异以及系统进化分析，期望能从分子水平上更为准确地获知安徽省分布桑种质资源之间的亲缘关系，为进一步探讨桑属植物的进化、起源提供基础的参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料取自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑苗选育中心。所有供试材料经专家鉴定后，采摘上部枝条的嫩叶，用硅胶干燥保存，带回实验室用于提取基因组DNA。材料名称及来源见表1。
1.2 方法
1.2.1 桑叶DNA的提取和检测
取约0.2 g新鲜叶片，于液氮中研成粉；将上述粉末转入预冷的2 mL离心管中，立即加入1 mL CTAB提取缓冲液，于65 ℃保温30 min，其间不时摇动；加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，以12 000 r/min离心10 min；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，以12 000 r/min离心10 min；将上层液相转入新的2 mL离心管中，加入1倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置30 min；以4 000 r/min离心10 min，去上清液，用70 %乙醇漂洗，沉淀吹干，风干后加入40 μL的TE缓冲液溶解DNA；用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Tanon UVP凝胶成像系统观察电泳结果。 1.2.2 PCR扩增与测序
根据GenBank提供的序列设计引物序列如下：
ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，
ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
PCR擴增反应总体积50 μL，反应体系为：DNA模板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，10×Easy Taq Buffer 5 μL，Easy Taq DNA polymerase 1 μL，ddH2O 35 μL。
扩增程序： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min。
用1.2 %琼脂糖凝胶检测扩增结果。扩增成功的PCR产物经纯化、连接转化，送往上海生物工程技术服务有限公司测序。
1.3 数据分析
测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，用Clustalx软件进行比对。根据已公布的鲁桑（ AM042003）18S rRNA基因3′端、26S rRNA基因5′端碱基序列，确定本试验各供试材料的ITS序列范围，除去非序列部分；用DNAstar软件分析序列的长度、G+C含量及变异位点；用PAUPVersion4.0b10软件中的MP法分析不同桑树种质间的亲缘关系。
2 结果与分析
2.1 总基因组提取结果
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，12份供试桑样品所得条带整齐单一，无拖尾现象， DNA提取质量较好（图2），将其回收后存放于-20 ℃冰箱保存备用。
2.2 PCR结果
琼脂糖凝胶电泳检测显示，12份供试桑样品的目的条带单一（图3），证明引物特异性良好。
2.3 12份安徽地方桑品种的ITS序列
12份供试桑种质资源ITS序列长度、G+C含量见表2。ITS序列的604个位点中，发现522个固定位点，82个变异位点，80个多态性位点，简约信息位点数为7。其中5.8 S高度保守，在检测的样品中未发现变异；ITS1序列区间变异较多，ITS2序列区间存在少量变异，主要核苷酸多样性Pi值为0.014 22，Theta值为0.039 23，数值都很低，认为桑属ITS序列没有出现假基因，这与被子植物的ITS致同进化规律是一致的。根据Pi值的分布，变异主要发生在ITS1，其次是ITS2，5.8 S的变异很低。
2.4 桑种质资源的亲缘关系
利用DNASTAR分析软件对供试桑材料的ITS序列进行了同源性分析，发现桑属植物内大部分材料间的相似系数在90 %以上，亲缘关系较近；以构树作为外类群，用PAUP Version 4.0b10软件，采用最大简约法（MP法）构建系统进化树（图4）。系统进化树先分出构树，把其余供试桑种质资源材料分为2大枝，其中分支1先将华明桑分出，7707、皖桑1号、皖桑优1号聚为一支；分支2先将长果桑、红星5号单独分出，而金寨九龙桑、孪枝桑、皖花桑、皖果桑、皖杂2号、杂品1号聚为一支，说明它们有较近的亲缘关系。
3 讨论
分子系统进化树的建树结果表明，桑科中的构属与桑属分别单独聚为一类，说明桑属属于单系，这一结果与Zhao等[13]对叶绿体trnL-trnF间隔区序列的研究结果相一致。桑树为异花授粉植物，在自然界分布广泛，很容易发生自然杂交，因而具有相对复杂的遗传背景。传统的分析方法如形态学、同工酶、染色体核型分析等，不能够解决桑树在系统进化以及分类中出现的许多分歧，更不能够适应急需的种质资源鉴定以及桑树育种的需求。在桑树中已陆续开展了分子标记研究，但主要是利用RAPD 技术来进行探讨，具有一定的局限性。因此，本研究对收集的部分安徽省特色桑属植物的ITS序列进行了分析，通过揭示DNA分子核苷酸的变异来研究桑属的系统发育，比一般方法更直观、准确。将来有望在桑属植物中利用多重序列来研究其系统发育和进化。
分子标记作为遗传标记的一种重要类型，具有数量多、多态性高、以DNA为存在形式等一系列优点，目前已经在种质资源的鉴定和分类、目标基因的定位、遗传图谱构建等方面取得了突破性的进展。相信随着新的分子标记的不断发现，在桑树上利用分子标记技术将有更加广阔的应用前景。
参考文献
[1] 焦 锋，楼程富，张有做，等. 桑树变异株系基因组DNA扩增多态性（RAPD）研究[J].蚕业科学，2001，27（3）：165-169.
[2] 傅大煦，张 辉，陈 纹，等. 新疆药用桑树9个栽培群体的RAPD分析[J].中草药，2004，35（9）：1 053-1 056.
[3] Alvarez I，Wendel J F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，29（3）：417-434.
[4] Bellarosa R，Simeone MC，Papini A，et al. Utitity of ITS sequence data for phylogenetic reconstruction of Italian Quercus spp[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution. 2005，34（2）：355-370.
[5] Kay K M，Reeves P A，Olmstead R G，et al. Rapid speciation and the evolution of hummingbird pollination in neotropical Costus subgenus Costus（Costaceae）：evidence from nrDNA ITS and ETS sequences[J]. American Journal of Botany，2005，92（11）：1 899-1 910. [6] Kress W J，Liu A Z，Newman M，et al. The molecular phylogeny of Alpinia （Zingiberaceae）：a complex and polyphyletic genus of gingers[J]. American Journal of Botany，2005，92（1）：167-178.
[7] Groth-Malonek M，Heinrichs J，Schneider H，et al. Phylogenetic relationships in the Lejeuneaceae （Hepaticae）inferred using ITS sequences of nuclear ribosomal DNA[J]. Organisms Diversity Evolution， 2004，4（1-2）：51-57.
[8] Schwarzbach A E，Ricklefs R E. Systematic affinities of Rhizophoraceae and Anisophylleaceae，and intergeneric relationships within Rhizophoraceae， based on chloroplast DNA，nuclear ribosomal DNA，and morphology[J]，American Journal of Botany，2000，87（4）：547-564.
[9] 陳仁芳，余茂德，刘秀群，等. 桑种质资源ITS序列与系统进化分析[J]. 中国农业科学，2010，43（9）：1 771-1 781.
[10] 向仲怀，张孝勇，余茂德，等. 采用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）在桑属植物系统学研究的应用初报[J]. 蚕业科学，1995，21（4）：203-208.
[11] 冯丽春，杨光伟，余茂德，等. 利用RAPD对桑属植物种间亲缘关系的研究[J]. 中国农业科学，1997，30（1）：52-56.
[12] 杨光伟，冯丽春，敬成俊，等. 桑树种群遗传结构变异分析[J]. 蚕业科学，2003，29（4）：6-12.
[13] Zhao W，Miao X，Jia S，et al. Isolation and characterization of microsatellite loci from the mulberry，Morus L.[J]. Plant Science，2005，168（2）：519-525.
[14] 汪 伟，王兴科，朱昱萍，等. 基于trnL内含子序列的桑属植物分子系统学初探[J]. 蚕业科学，2008，34（2）：892-897.
[15] 史全良，赵卫国. 桑树ITS序列测定及特点的初步分析[J]. 蚕业科学，2001，27（2）：140-142.
[16] 赵卫国，潘一乐，张志芳. 桑属植物 ITS 序列研究与系统发育分析[J]. 蚕业科学，2004，30（1）：11-14。
关键词 桑树种质资源 ；ITS序列 ；进化分析
中图分类号 Q341
An Analysis on Genetic Relationship of Mulberry Germplasm Resources
Collected in Anhui Province Based on ITS Marker
WANG Yuting LI Ruixue SUN Fan WANG Wei WANG Taichu
（Sericultural Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230061）
Abstract Ribosome transcribed spacer（ITS）is the most widely used nuclear DNA sequence in molecular systems. The sequencing analysis was carried out by using the total DNA extraction and PCR amplification method. According to the sequence of Morus multicaulis gene，the ITS sequence range was determined and sequence alignment was performed. By analyzing the sequence length，G + C content and mutation loci and genetic divergence，the phylogenetic relationship between the collected mulberry germplasm in Anhui Province was discussed， which provided the basic reference for the further study of phylogenetic evolution between mulberry plants.
Key words Mulberry germplasm resources ；ITS marker ；phylogeny
桑属（Morus）为桑科的模式属，由Linne（1753）建立。桑树自然杂交普遍，形态学上种间界限相对模糊，属内种数、系统发育关系历来存在较大争议，因而在分子系统学中分类十分困难。从20世纪90 年代起，利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术围绕桑属植物的亲缘关系及系统进化等开展了一系列的研究[1-2]。进一步研究发现，核糖体内转录间隔区（intergenic transcribed spacer，ITS）序列是核基因组中进化较快的DNA片段，遗传信息位点十分丰富。
核糖体内转录间隔区（ITS）位于核糖体基因中18S、26S之间，是被5.8S分隔开的2段DNA片段[3]，分别为ITS1和ITS2（图1）。在被子植物基因组中，ITS序列是高度重复的串联序列，由于没有加入成熟核糖体，选择压力小，进化速度快，而其相对长度又具有保守性，适宜于对低分类群进行系统发育分析[4-6]，能够满足探讨属内种间和较近的族间、属间系统发育关系的要求[7-8]，已经逐渐成为被子植物亲缘关系及系统进化分析的重要工具[9]。向仲怀等[10]于1995年应用RAPD分子标记，最早开展对桑属分子系统学的研究，获得了桑属9个种的DNA多态性指纹图谱，得到了系统树状图。冯丽春等[11]也通过RAPD的方法，分析了桑属12个种、2个变种的遗传多样性。杨光偉等[12]采用显性分子标记RAPD技术，对桑属植物亲缘关系的分析结果认为川桑是最原始的。Zhao等[13]在对桑属进行分子系统学研究时将RAPD标记和微卫星DNA结合，分析结果表明蒙桑（M.mongolica）最原始。汪伟等[14]测定了亮氨酸转运RNA基因内含子序列（trnL），探讨了桑属的遗传距离，结果认为蒙桑是最原始的类群。史全良等[15]首次对蒙桑的ITS序列进行了报道。赵卫国等[16]收集了桑属9个种和3个变种，一共13份桑资源材料，将构树作为外类群，对ITS序列进行了测定，系统分析的结果认为，桑属为单系；蒙桑亲缘关系最远，在系统进化树中首先被分出，鬼桑和鸡桑聚为一枝，白桑进化程度最高。
本研究收集了12种安徽特色桑品种资源（表1），对实验材料的ITS序列进行了遗传变异以及系统进化分析，期望能从分子水平上更为准确地获知安徽省分布桑种质资源之间的亲缘关系，为进一步探讨桑属植物的进化、起源提供基础的参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料取自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑苗选育中心。所有供试材料经专家鉴定后，采摘上部枝条的嫩叶，用硅胶干燥保存，带回实验室用于提取基因组DNA。材料名称及来源见表1。
1.2 方法
1.2.1 桑叶DNA的提取和检测
取约0.2 g新鲜叶片，于液氮中研成粉；将上述粉末转入预冷的2 mL离心管中，立即加入1 mL CTAB提取缓冲液，于65 ℃保温30 min，其间不时摇动；加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，以12 000 r/min离心10 min；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，以12 000 r/min离心10 min；将上层液相转入新的2 mL离心管中，加入1倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置30 min；以4 000 r/min离心10 min，去上清液，用70 %乙醇漂洗，沉淀吹干，风干后加入40 μL的TE缓冲液溶解DNA；用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Tanon UVP凝胶成像系统观察电泳结果。 1.2.2 PCR扩增与测序
根据GenBank提供的序列设计引物序列如下：
ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，
ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
PCR擴增反应总体积50 μL，反应体系为：DNA模板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，10×Easy Taq Buffer 5 μL，Easy Taq DNA polymerase 1 μL，ddH2O 35 μL。
扩增程序： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min。
用1.2 %琼脂糖凝胶检测扩增结果。扩增成功的PCR产物经纯化、连接转化，送往上海生物工程技术服务有限公司测序。
1.3 数据分析
测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，用Clustalx软件进行比对。根据已公布的鲁桑（ AM042003）18S rRNA基因3′端、26S rRNA基因5′端碱基序列，确定本试验各供试材料的ITS序列范围，除去非序列部分；用DNAstar软件分析序列的长度、G+C含量及变异位点；用PAUPVersion4.0b10软件中的MP法分析不同桑树种质间的亲缘关系。
2 结果与分析
2.1 总基因组提取结果
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，12份供试桑样品所得条带整齐单一，无拖尾现象， DNA提取质量较好（图2），将其回收后存放于-20 ℃冰箱保存备用。
2.2 PCR结果
琼脂糖凝胶电泳检测显示，12份供试桑样品的目的条带单一（图3），证明引物特异性良好。
2.3 12份安徽地方桑品种的ITS序列
12份供试桑种质资源ITS序列长度、G+C含量见表2。ITS序列的604个位点中，发现522个固定位点，82个变异位点，80个多态性位点，简约信息位点数为7。其中5.8 S高度保守，在检测的样品中未发现变异；ITS1序列区间变异较多，ITS2序列区间存在少量变异，主要核苷酸多样性Pi值为0.014 22，Theta值为0.039 23，数值都很低，认为桑属ITS序列没有出现假基因，这与被子植物的ITS致同进化规律是一致的。根据Pi值的分布，变异主要发生在ITS1，其次是ITS2，5.8 S的变异很低。
2.4 桑种质资源的亲缘关系
利用DNASTAR分析软件对供试桑材料的ITS序列进行了同源性分析，发现桑属植物内大部分材料间的相似系数在90 %以上，亲缘关系较近；以构树作为外类群，用PAUP Version 4.0b10软件，采用最大简约法（MP法）构建系统进化树（图4）。系统进化树先分出构树，把其余供试桑种质资源材料分为2大枝，其中分支1先将华明桑分出，7707、皖桑1号、皖桑优1号聚为一支；分支2先将长果桑、红星5号单独分出，而金寨九龙桑、孪枝桑、皖花桑、皖果桑、皖杂2号、杂品1号聚为一支，说明它们有较近的亲缘关系。
3 讨论
分子系统进化树的建树结果表明，桑科中的构属与桑属分别单独聚为一类，说明桑属属于单系，这一结果与Zhao等[13]对叶绿体trnL-trnF间隔区序列的研究结果相一致。桑树为异花授粉植物，在自然界分布广泛，很容易发生自然杂交，因而具有相对复杂的遗传背景。传统的分析方法如形态学、同工酶、染色体核型分析等，不能够解决桑树在系统进化以及分类中出现的许多分歧，更不能够适应急需的种质资源鉴定以及桑树育种的需求。在桑树中已陆续开展了分子标记研究，但主要是利用RAPD 技术来进行探讨，具有一定的局限性。因此，本研究对收集的部分安徽省特色桑属植物的ITS序列进行了分析，通过揭示DNA分子核苷酸的变异来研究桑属的系统发育，比一般方法更直观、准确。将来有望在桑属植物中利用多重序列来研究其系统发育和进化。
分子标记作为遗传标记的一种重要类型，具有数量多、多态性高、以DNA为存在形式等一系列优点，目前已经在种质资源的鉴定和分类、目标基因的定位、遗传图谱构建等方面取得了突破性的进展。相信随着新的分子标记的不断发现，在桑树上利用分子标记技术将有更加广阔的应用前景。
参考文献
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[9] 陳仁芳，余茂德，刘秀群，等. 桑种质资源ITS序列与系统进化分析[J]. 中国农业科学，2010，43（9）：1 771-1 781.
[10] 向仲怀，张孝勇，余茂德，等. 采用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）在桑属植物系统学研究的应用初报[J]. 蚕业科学，1995，21（4）：203-208.
[11] 冯丽春，杨光伟，余茂德，等. 利用RAPD对桑属植物种间亲缘关系的研究[J]. 中国农业科学，1997，30（1）：52-56.
[12] 杨光伟，冯丽春，敬成俊，等. 桑树种群遗传结构变异分析[J]. 蚕业科学，2003，29（4）：6-12.
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