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摘要：目的 观察益气化瘀养阴解毒方药物血清对人肺癌细胞A549增殖及周期的影响。方法 大鼠灌胃制备益气化瘀养阴解毒方药物血清，采用MTT法观察药物血清干预24、48、72 h后对细胞增殖的作用（分为空白组及药物血清高、中、低剂量组）采用流式细胞检测分析药物血清干预24 h对细胞周期的影响（分为空白组、生长液组及药物血清高、中剂量组）。结果 各药物血清组与空白组之间的吸光度差异有统计学意义（P<0.05），随着作用时间的延长，其吸光度逐渐降低，抑制率逐渐增高（P<0.05）。药物血清组细胞周期G1期增多，G2期及S期减少。结论 益气化瘀养阴解毒方对肺癌细胞具有抑制作用，可能与其抑制细胞分裂有关。
关键词：益气化瘀养阴解毒方；细胞增殖；细胞周期；人肺癌细胞A549；药物血清
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0034-02
肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，复发转移快，对其防治研究非常重要。临床观察表明，益气化瘀养阴解毒方治疗肺癌疗效确切[1]，有必要对其作用机制进行深入研究。为此，采用我们益气化瘀养阴解毒方药物血清进行了对人肺癌A549细胞增殖及凋亡影响的实验研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞株、药物与动物
人肺癌A549细胞由中南大学湘雅医学院细胞中心提供；中药材购于湖南省药材公司；SD大鼠购于长沙市东创实验动物科技服务部，体质量200～250 g，动物许可证号：2009-0004。
1.2 主要试剂与仪器
1640培养基（hyclone），新生牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（美国，Sigma），噻唑蓝（美国，Sigma），二甲基亚砜（DMSO，
北京北化精细化学公司）。低速离心机（上海手术器械厂），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），CO2恒温孵育箱（美国，SHEL·LAB），倒置生物显微镜（南京江南光电股份有限公司），96孔培养板（CORNING，USA），流式细胞仪（Cytomics FC 500，Beckman Coulter）。
1.3 药物制备
益气化瘀养阴解毒方主要由黄芪、人参、女贞子、蚤休、莪术、干蟾皮、壁虎等组成。药物先粉碎成粗颗粒，用8倍温水浸泡0.5 h，电热套加热先煎1 h，趁热过滤，药渣再加8倍水煎煮2次，每次30 min，趁热滤过，将3次水煎溶液混匀，过滤，减压浓缩至浓度为2 g/mL。4 ℃保存。
1.4 药物血清制备
选用正常成年大鼠16只，雌雄各半。每日灌胃益气化瘀养阴解毒方煎液，剂量相当于原药材22 g/kg；空白组大鼠每日灌胃等量生理盐水。在灌胃前12 h禁食不禁水，灌胃2次/d，连续3 d后禁食，于第4日最后1次灌胃后1 h腹主动脉采血，2 000 r/min离心10 min，合并同组动物血清，用0.22 ?m微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。使用时以1640培养基稀释。
1.5 人肺癌细胞的培养
人肺癌A549细胞株，用含10%新生牛血清的1640培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞铺满80%～90%时开始传代，约1～2 d传代1次。
1.6 人肺癌A549细胞生长抑制率检测
采用MTT法[2]。细胞以含2%新生牛血清的1640培养基饥饿24 h后，用胰酶消化，用常规培养基配成细胞悬液，浓度为4×104/mL，种入96孔板，每孔200 ?L。板周边的孔以无菌PBS填充，防止边缘效应。在37 ℃、5%CO2的培养箱内培养16 h后，分别加入各组培养基200 ?L，即药物血清高、中、低剂量组（24%、12%、6%）及空白组。每组设5个平行孔，继续培养24、48、72 h。加入MTT溶液20 ?L继续培养4 h后，终止培养，小心吸去培养液，加入DMSO 150 ?L/孔，在摇床上轻轻振荡10 min， 在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A值），比色时以空白孔调零。根据公式计算细胞生长抑制率（IR）：IR=（空白组A值-给药组A值）/对照组A值×100%。
1.7 流式细胞仪检测细胞周期
人肺癌A549细胞以含2%新生牛血清的1640培养基饥饿24 h后传代，随机分为药物血清高、中剂量组及空白组。培养24 h后将培养细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，加培养基用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。1 000 r/min离心5 min弃上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1 000 r/min离心5 min，留0.5 mL PBS，加入75%冰乙醇固定，-20 ℃保存。检测时离心除去乙醇，用PBS洗1次，在离心管中留1 mL PBS打散细胞团，加入Rnase（10 mg/mL），37 ℃置1 h，加碘化丙啶（100 ?g/mL）染色，室温避光染色30 min，计数10 000个细胞，上机检测。
1.8 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，所有数据均以—x±s
表示，均数间比较采用方差分析，率的比较用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用
益气化瘀养阴解毒方不同浓度药物血清与空白组之间的细胞吸光度差异均有统计学意义（P<0.05），且随着作用时间的延长，抑制率逐渐增高（P<0.05），高、中剂量组优于低剂量组（P<0.05）。见表1。
2.2 加药24 h后对人肺癌A549细胞周期的影响
加药后24 h， 含药血清组G1期细胞数目比例增多，与空白组之间有明显差异（P<0.05）。见表2。
3 讨论
益气化瘀养阴解毒方是临床上治疗肿瘤的经验方，组方药物富含人参皂苷、多糖、莪术醇、動物多肽毒素、糖蛋白等多种抗肿瘤活性成分。
MTT法反映不同肿瘤细胞对各种抗肿瘤药物的敏感性差异[3]。本实验结果表明，选用大鼠制备益气化瘀养阴解毒方药物血清，作用于人肺癌A549细胞不同时间后，细胞的生长受到不同程度的抑制，说明益气化瘀解毒方具有抑制细胞增殖的作用。细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为3期，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。本研究通过流式细胞检测发现，用药组细胞G1期细胞明显增多。说明该方抑制人肺癌A549细胞增殖的机理可能为抑制细胞分裂，为进一步研究奠定了基础。
参考文献：
[1] 蔡美，蒋益兰，曾普华，等.益气养阴化瘀解毒方治疗肺癌脑转移17例[J].湖南中医杂志，2011，27（5）：50-51.
[2] 李杰，刘玉琴.MTT法在肿瘤研究中的改良与应用进展[J].中国肿瘤临床，1998，25（4）：312-313.
[3] 杨宗华，金逸，李晓诗，等.MTT法研究肿瘤细胞对化疗药物敏感性的临床意义[J].实用肿瘤杂志，2002，17（2）：43.
（收稿日期：2012-07-20，编辑：华强）
关键词：益气化瘀养阴解毒方；细胞增殖；细胞周期；人肺癌细胞A549；药物血清
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0034-02
肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，复发转移快，对其防治研究非常重要。临床观察表明，益气化瘀养阴解毒方治疗肺癌疗效确切[1]，有必要对其作用机制进行深入研究。为此，采用我们益气化瘀养阴解毒方药物血清进行了对人肺癌A549细胞增殖及凋亡影响的实验研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞株、药物与动物
人肺癌A549细胞由中南大学湘雅医学院细胞中心提供；中药材购于湖南省药材公司；SD大鼠购于长沙市东创实验动物科技服务部，体质量200～250 g，动物许可证号：2009-0004。
1.2 主要试剂与仪器
1640培养基（hyclone），新生牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（美国，Sigma），噻唑蓝（美国，Sigma），二甲基亚砜（DMSO，
北京北化精细化学公司）。低速离心机（上海手术器械厂），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），CO2恒温孵育箱（美国，SHEL·LAB），倒置生物显微镜（南京江南光电股份有限公司），96孔培养板（CORNING，USA），流式细胞仪（Cytomics FC 500，Beckman Coulter）。
1.3 药物制备
益气化瘀养阴解毒方主要由黄芪、人参、女贞子、蚤休、莪术、干蟾皮、壁虎等组成。药物先粉碎成粗颗粒，用8倍温水浸泡0.5 h，电热套加热先煎1 h，趁热过滤，药渣再加8倍水煎煮2次，每次30 min，趁热滤过，将3次水煎溶液混匀，过滤，减压浓缩至浓度为2 g/mL。4 ℃保存。
1.4 药物血清制备
选用正常成年大鼠16只，雌雄各半。每日灌胃益气化瘀养阴解毒方煎液，剂量相当于原药材22 g/kg；空白组大鼠每日灌胃等量生理盐水。在灌胃前12 h禁食不禁水，灌胃2次/d，连续3 d后禁食，于第4日最后1次灌胃后1 h腹主动脉采血，2 000 r/min离心10 min，合并同组动物血清，用0.22 ?m微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。使用时以1640培养基稀释。
1.5 人肺癌细胞的培养
人肺癌A549细胞株，用含10%新生牛血清的1640培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞铺满80%～90%时开始传代，约1～2 d传代1次。
1.6 人肺癌A549细胞生长抑制率检测
采用MTT法[2]。细胞以含2%新生牛血清的1640培养基饥饿24 h后，用胰酶消化，用常规培养基配成细胞悬液，浓度为4×104/mL，种入96孔板，每孔200 ?L。板周边的孔以无菌PBS填充，防止边缘效应。在37 ℃、5%CO2的培养箱内培养16 h后，分别加入各组培养基200 ?L，即药物血清高、中、低剂量组（24%、12%、6%）及空白组。每组设5个平行孔，继续培养24、48、72 h。加入MTT溶液20 ?L继续培养4 h后，终止培养，小心吸去培养液，加入DMSO 150 ?L/孔，在摇床上轻轻振荡10 min， 在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A值），比色时以空白孔调零。根据公式计算细胞生长抑制率（IR）：IR=（空白组A值-给药组A值）/对照组A值×100%。
1.7 流式细胞仪检测细胞周期
人肺癌A549细胞以含2%新生牛血清的1640培养基饥饿24 h后传代，随机分为药物血清高、中剂量组及空白组。培养24 h后将培养细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，加培养基用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。1 000 r/min离心5 min弃上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1 000 r/min离心5 min，留0.5 mL PBS，加入75%冰乙醇固定，-20 ℃保存。检测时离心除去乙醇，用PBS洗1次，在离心管中留1 mL PBS打散细胞团，加入Rnase（10 mg/mL），37 ℃置1 h，加碘化丙啶（100 ?g/mL）染色，室温避光染色30 min，计数10 000个细胞，上机检测。
1.8 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，所有数据均以—x±s
表示，均数间比较采用方差分析，率的比较用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用
益气化瘀养阴解毒方不同浓度药物血清与空白组之间的细胞吸光度差异均有统计学意义（P<0.05），且随着作用时间的延长，抑制率逐渐增高（P<0.05），高、中剂量组优于低剂量组（P<0.05）。见表1。
2.2 加药24 h后对人肺癌A549细胞周期的影响
加药后24 h， 含药血清组G1期细胞数目比例增多，与空白组之间有明显差异（P<0.05）。见表2。
3 讨论
益气化瘀养阴解毒方是临床上治疗肿瘤的经验方，组方药物富含人参皂苷、多糖、莪术醇、動物多肽毒素、糖蛋白等多种抗肿瘤活性成分。
MTT法反映不同肿瘤细胞对各种抗肿瘤药物的敏感性差异[3]。本实验结果表明，选用大鼠制备益气化瘀养阴解毒方药物血清，作用于人肺癌A549细胞不同时间后，细胞的生长受到不同程度的抑制，说明益气化瘀解毒方具有抑制细胞增殖的作用。细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为3期，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。本研究通过流式细胞检测发现，用药组细胞G1期细胞明显增多。说明该方抑制人肺癌A549细胞增殖的机理可能为抑制细胞分裂，为进一步研究奠定了基础。
参考文献：
[1] 蔡美，蒋益兰，曾普华，等.益气养阴化瘀解毒方治疗肺癌脑转移17例[J].湖南中医杂志，2011，27（5）：50-51.
[2] 李杰，刘玉琴.MTT法在肿瘤研究中的改良与应用进展[J].中国肿瘤临床，1998，25（4）：312-313.
[3] 杨宗华，金逸，李晓诗，等.MTT法研究肿瘤细胞对化疗药物敏感性的临床意义[J].实用肿瘤杂志，2002，17（2）：43.
（收稿日期：2012-07-20，编辑：华强）