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摘要[目的] 研究优化橡子粉发酵乙醇的试验条件。[方法] 以采于牡丹江林口的橡子为原料，以乙醇浓度为指标，通过单因素和正交试验考察发酵时间、接种量、转速及发酵温度4个因素对橡子粉发酵后乙醇浓度的影响。[结果]试验确定了各因素对原料发酵的影响程度大小依次为：发酵时间、发酵温度、转速、接种量；橡子粉发酵生产乙醇的最佳条件：发酵液接种量3%，摇床转速120 r/min，发酵温度32 ℃，发酵时间为接种培养开始至96 h结束，此条件下橡子粉的酒精转化率约为16.37%。 [结论]研究可为橡子原料量化生产燃料乙醇奠定基础。
关键词橡子；乙醇化；试验研究
中图分类号S789.7文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-323-03
Abstract[Objective] To optimize experimental conditions of ethanol fermentation by acorn powder. [Method] With acorn collected from Linkou， Mudanjiang as raw material， ethanol concentration as indicator， through single factor and orthogonal test， the effects of fermentation time， inoculation amount， rotation speed and fermentation temperature on ethanol concentration were investigated. [Result] The order of influence factors is： fermentation time， fermentation temperature， rotation speed， inoculation amount； the optimal conditions ethanol fermentation by acorn powder are： fermentation broth 3%， shaking speed 120 r/min， fermentation temperature 32 ℃， fermentation time 96 h， under the above conditions， alcohol conversion rate of acorn powder is about 16.37%. [Conclusion] The research can lay the foundation for the production of fuel ethanol with acorn.
Key wordsAcorn； Ethanol； Experimental study
橡子種仁中淀粉含量高，是良好的淀粉质原料，也是代替粮食作物制备燃料乙醇的理想来源。东北林区橡实资源丰富，利用橡子作为燃料乙醇的原料，可充分利用林区非林木资源生产清洁燃料，节约大量粮食。因此，以橡子为原料发酵生产燃料乙醇是橡子较好的利用途径之一。
橡子淀粉经糖化处理后转化为可供酵母发酵的糖类（主要是单糖及部分二糖和三糖），其后通过酵母对糖化液进行乙醇化发酵。发酵时，酵母主要通过糖酵解途径进行同型酒精发酵，即由EMP途径代谢产生丙酮酸并经过脱羧释放CO2，在这个过程中，中间产物乙醛被还原成乙醇，同时释放出热量。
笔者对橡子粉发酵乙醇的试验条件进行研究，通过试验确定了具体条件对原料发酵的影响程度，橡子粉以最佳条件发酵生产乙醇，能提高橡子淀粉的酒精转化率，为橡子原料量化生产燃料乙醇奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌种及原料。供试菌种南阳6号，由黑龙江省微生物研究所提供。原料橡子，采于牡丹江林口，晒干后脱壳，粉碎后烘干备用。
1.1.2主要试剂。葡萄糖、酵母膏、蛋白胨等均为分析纯；淀粉酶，5 000 U/g，北京东华强盛试剂有限公司；糖化酶，50 000 U/g，湖南省津市市新型发酵有限公司。
1.1.3主要仪器。JG200型多功能粉碎机，上海广沙工贸有限公司；电子天平，梅特勒-托利多公司；手提式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；摇床，上海智城分析仪器制造有限责任公司；糖度计、温度计等。
1.1.4菌种活化培养基。蛋白胨 2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，pH 6.0（固体培养基加琼脂1.5%～2.0%），115 ℃灭菌15 min。发酵液制备：取经过处理的橡子粉20 g，将橡子粉水解后配制成发酵液，调节pH为6.0，并分装于250 ml三角瓶中，冷却后在无菌条件下接入活化好的酵母菌种。
1.2方法
1.2.1单因素试验。以乙醇浓度为指标，考察发酵时间、接种量、转速及发酵温度4个单因素对发酵后乙醇浓度的影响。发酵时间的考察范围为48～96 h；接种量的考察范围为1%～3%；转速的考察范围为80～120 r/min；发酵温度的考察范围为28～36 ℃。
1.2.2正交试验。在单因素试验的基础上，以乙醇浓度为考察目标，选定发酵时间、接种量、转速、温度为考察因素，设计4因素3水平L9（34）正交试验。各因素和水平见表1。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1发酵时间对乙醇浓度的影响。固定种液接种量为2%，温度为28 ℃，转速为80 r/min，以乙醇浓度为指标，考察48、72、96 h不同发酵时间对发酵的影响。由图1可见，发酵到48 h时，乙醇浓度值较低，发酵速率慢，处于酵母发酵的前期，乙醇浓度较低的原因可能是菌体利用其葡萄糖进行自身的生长；48～72 h时，乙醇浓度增长迅速，发酵速率增加，此时发酵速率最快，为主发酵期；从72～96 h时，乙醇浓度增长趋于平缓，发酵速率变化不大，可以看出发酵时间对橡子原料发酵的影响较大。 2.1.2接种量对乙醇浓度的影响。固定发酵时间为72 h，温度为28 ℃，转速为80 r/min，以乙醇浓度为指标，考察1%、2%、3%不同接种量对发酵的影响。由图2可见，随着接种量增加，乙醇浓度增加；接种量在1%～2%范围时，乙醇浓度随着接种量的增加增长较快；接种量在2%～3%范围时，乙醇浓度随着接种量的增加而缓慢增长，此时菌种主要利用发酵液中葡萄糖进行自身菌体生长。接种量过多或过少，都会影响菌体发酵作用，接种量太小，会延长发酵周期、降低酵母菌种活力；接种量过大，易导致菌种衰老，不利于酒精高产。因此选择接种量在2%～3%为较适宜的接种范围，保证在较短的发酵周期内得到较高的乙醇产率。固定发酵时间72 h，温度28 ℃，接种量2%，以乙醇浓度为指标，考察80、100、120 r/min不同转速对发酵的影响。由图3可见，在低供氧条件下，酵母发酵葡萄糖产生少量乙醇，乙醇产量随着转速增加而不断增加，当转速为100～120 r/min时，乙醇含量趋于平缓，残葡萄糖浓度下降缓慢。因此，转速宜选择在100 r/min左右。
综上结果，发酵时间、接种量、发酵温度、摇床转速等都是影响发酵效果的重要指标，通过单因素试验初步确定了各参数的最佳范围，在这样的条件下进行发酵可以获得较高的酒精产率。
2.2正交试验结果改变发酵温度、时间、接种量等条件，测定不同发酵条件下所能得到的乙醇浓度，并通过对试验水平的筛选得到最佳组合条件，使发酵后的乙醇浓度达到最大，正交试验结果见表2。
由表2的极差分析结果可以看出，对橡子粉发酵产生乙醇浓度的影响顺序大小依次为：A、D、C、B，即发酵时间、发酵温度、转速、接种量，最优组合为A3B3C3D2。发酵时间和发酵温度是影响橡子淀粉发酵后乙醇产量的主要因素。
2.3最佳试验条件的验证由正交试验结果分析得出发酵最优条件组合为A3B3C3D2，即发酵時间96 h，接种量3%，转速120 r/min，发酵温度32 ℃。通过试验验证，在此条件下发酵后乙醇浓度值约为26.83 g/L，其值是各组中最高的。
2.4酒精转化率的计算由上述试验得到橡子粉发酵后的乙醇浓度值约为26.83 g/L，此时，以粗淀粉产率为62.10%计算，利用橡子粉发酵乙醇的酒精转化率约为16.37%。
酒精转化率（%）=[酒精体积（ml）×酒精度（%）]/淀粉含量（g）×100%
3结论
通过单因素及正交设计试验结果确定了试验条件对发酵结果的影响程度大小依次为：发酵时间、发酵温度、转速、接种量。橡子淀粉发酵生产乙醇的最优组合条件为，发酵液接种量3%，摇床转速为120 r/min，发酵温度为32 ℃，发酵时间为接种培养开始至96 h结束，在该条件下橡子粉的酒精转化率约为16.37%。
参考文献
[1] 范红岩，宫殿良 橡子发酵转化燃料乙醇的工艺研究[J].化学工程师，2013（5）：76-78.
[2] 程荷芳，卫民，蒋剑春，等.橡子淀粉性质及酶解液化条件的优化[J].食品科技，2010（10）：102-105.
[3] 韩梅，戴速航，林荣峰，等.甜菜乙醇发酵条件的研究[J].可再生能源，2010（4）：72-75.
[4] 谢碧霞，李安平，田玉峰，等.响应面法优化橡实淀粉生料发酵生产燃料酒精工艺[J].中南林业科技大学学报，2010（12）：92-97.
[5] 梁玮，施翔星.木薯干发酵生产燃料乙醇潜力研究[J].中外能源，2010（5）：31-34.43卷26期栾泰龙等橡子粉乙醇化试验条件研究
关键词橡子；乙醇化；试验研究
中图分类号S789.7文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-323-03
Abstract[Objective] To optimize experimental conditions of ethanol fermentation by acorn powder. [Method] With acorn collected from Linkou， Mudanjiang as raw material， ethanol concentration as indicator， through single factor and orthogonal test， the effects of fermentation time， inoculation amount， rotation speed and fermentation temperature on ethanol concentration were investigated. [Result] The order of influence factors is： fermentation time， fermentation temperature， rotation speed， inoculation amount； the optimal conditions ethanol fermentation by acorn powder are： fermentation broth 3%， shaking speed 120 r/min， fermentation temperature 32 ℃， fermentation time 96 h， under the above conditions， alcohol conversion rate of acorn powder is about 16.37%. [Conclusion] The research can lay the foundation for the production of fuel ethanol with acorn.
Key wordsAcorn； Ethanol； Experimental study
橡子種仁中淀粉含量高，是良好的淀粉质原料，也是代替粮食作物制备燃料乙醇的理想来源。东北林区橡实资源丰富，利用橡子作为燃料乙醇的原料，可充分利用林区非林木资源生产清洁燃料，节约大量粮食。因此，以橡子为原料发酵生产燃料乙醇是橡子较好的利用途径之一。
橡子淀粉经糖化处理后转化为可供酵母发酵的糖类（主要是单糖及部分二糖和三糖），其后通过酵母对糖化液进行乙醇化发酵。发酵时，酵母主要通过糖酵解途径进行同型酒精发酵，即由EMP途径代谢产生丙酮酸并经过脱羧释放CO2，在这个过程中，中间产物乙醛被还原成乙醇，同时释放出热量。
笔者对橡子粉发酵乙醇的试验条件进行研究，通过试验确定了具体条件对原料发酵的影响程度，橡子粉以最佳条件发酵生产乙醇，能提高橡子淀粉的酒精转化率，为橡子原料量化生产燃料乙醇奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌种及原料。供试菌种南阳6号，由黑龙江省微生物研究所提供。原料橡子，采于牡丹江林口，晒干后脱壳，粉碎后烘干备用。
1.1.2主要试剂。葡萄糖、酵母膏、蛋白胨等均为分析纯；淀粉酶，5 000 U/g，北京东华强盛试剂有限公司；糖化酶，50 000 U/g，湖南省津市市新型发酵有限公司。
1.1.3主要仪器。JG200型多功能粉碎机，上海广沙工贸有限公司；电子天平，梅特勒-托利多公司；手提式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；摇床，上海智城分析仪器制造有限责任公司；糖度计、温度计等。
1.1.4菌种活化培养基。蛋白胨 2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，pH 6.0（固体培养基加琼脂1.5%～2.0%），115 ℃灭菌15 min。发酵液制备：取经过处理的橡子粉20 g，将橡子粉水解后配制成发酵液，调节pH为6.0，并分装于250 ml三角瓶中，冷却后在无菌条件下接入活化好的酵母菌种。
1.2方法
1.2.1单因素试验。以乙醇浓度为指标，考察发酵时间、接种量、转速及发酵温度4个单因素对发酵后乙醇浓度的影响。发酵时间的考察范围为48～96 h；接种量的考察范围为1%～3%；转速的考察范围为80～120 r/min；发酵温度的考察范围为28～36 ℃。
1.2.2正交试验。在单因素试验的基础上，以乙醇浓度为考察目标，选定发酵时间、接种量、转速、温度为考察因素，设计4因素3水平L9（34）正交试验。各因素和水平见表1。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1发酵时间对乙醇浓度的影响。固定种液接种量为2%，温度为28 ℃，转速为80 r/min，以乙醇浓度为指标，考察48、72、96 h不同发酵时间对发酵的影响。由图1可见，发酵到48 h时，乙醇浓度值较低，发酵速率慢，处于酵母发酵的前期，乙醇浓度较低的原因可能是菌体利用其葡萄糖进行自身的生长；48～72 h时，乙醇浓度增长迅速，发酵速率增加，此时发酵速率最快，为主发酵期；从72～96 h时，乙醇浓度增长趋于平缓，发酵速率变化不大，可以看出发酵时间对橡子原料发酵的影响较大。 2.1.2接种量对乙醇浓度的影响。固定发酵时间为72 h，温度为28 ℃，转速为80 r/min，以乙醇浓度为指标，考察1%、2%、3%不同接种量对发酵的影响。由图2可见，随着接种量增加，乙醇浓度增加；接种量在1%～2%范围时，乙醇浓度随着接种量的增加增长较快；接种量在2%～3%范围时，乙醇浓度随着接种量的增加而缓慢增长，此时菌种主要利用发酵液中葡萄糖进行自身菌体生长。接种量过多或过少，都会影响菌体发酵作用，接种量太小，会延长发酵周期、降低酵母菌种活力；接种量过大，易导致菌种衰老，不利于酒精高产。因此选择接种量在2%～3%为较适宜的接种范围，保证在较短的发酵周期内得到较高的乙醇产率。固定发酵时间72 h，温度28 ℃，接种量2%，以乙醇浓度为指标，考察80、100、120 r/min不同转速对发酵的影响。由图3可见，在低供氧条件下，酵母发酵葡萄糖产生少量乙醇，乙醇产量随着转速增加而不断增加，当转速为100～120 r/min时，乙醇含量趋于平缓，残葡萄糖浓度下降缓慢。因此，转速宜选择在100 r/min左右。
综上结果，发酵时间、接种量、发酵温度、摇床转速等都是影响发酵效果的重要指标，通过单因素试验初步确定了各参数的最佳范围，在这样的条件下进行发酵可以获得较高的酒精产率。
2.2正交试验结果改变发酵温度、时间、接种量等条件，测定不同发酵条件下所能得到的乙醇浓度，并通过对试验水平的筛选得到最佳组合条件，使发酵后的乙醇浓度达到最大，正交试验结果见表2。
由表2的极差分析结果可以看出，对橡子粉发酵产生乙醇浓度的影响顺序大小依次为：A、D、C、B，即发酵时间、发酵温度、转速、接种量，最优组合为A3B3C3D2。发酵时间和发酵温度是影响橡子淀粉发酵后乙醇产量的主要因素。
2.3最佳试验条件的验证由正交试验结果分析得出发酵最优条件组合为A3B3C3D2，即发酵時间96 h，接种量3%，转速120 r/min，发酵温度32 ℃。通过试验验证，在此条件下发酵后乙醇浓度值约为26.83 g/L，其值是各组中最高的。
2.4酒精转化率的计算由上述试验得到橡子粉发酵后的乙醇浓度值约为26.83 g/L，此时，以粗淀粉产率为62.10%计算，利用橡子粉发酵乙醇的酒精转化率约为16.37%。
酒精转化率（%）=[酒精体积（ml）×酒精度（%）]/淀粉含量（g）×100%
3结论
通过单因素及正交设计试验结果确定了试验条件对发酵结果的影响程度大小依次为：发酵时间、发酵温度、转速、接种量。橡子淀粉发酵生产乙醇的最优组合条件为，发酵液接种量3%，摇床转速为120 r/min，发酵温度为32 ℃，发酵时间为接种培养开始至96 h结束，在该条件下橡子粉的酒精转化率约为16.37%。
参考文献
[1] 范红岩，宫殿良 橡子发酵转化燃料乙醇的工艺研究[J].化学工程师，2013（5）：76-78.
[2] 程荷芳，卫民，蒋剑春，等.橡子淀粉性质及酶解液化条件的优化[J].食品科技，2010（10）：102-105.
[3] 韩梅，戴速航，林荣峰，等.甜菜乙醇发酵条件的研究[J].可再生能源，2010（4）：72-75.
[4] 谢碧霞，李安平，田玉峰，等.响应面法优化橡实淀粉生料发酵生产燃料酒精工艺[J].中南林业科技大学学报，2010（12）：92-97.
[5] 梁玮，施翔星.木薯干发酵生产燃料乙醇潜力研究[J].中外能源，2010（5）：31-34.43卷26期栾泰龙等橡子粉乙醇化试验条件研究