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摘要：目的 探究复方桑叶消痤凝胶对ICR小鼠痤疮模型的相关抗炎影响。方法 将6～8周龄雌性ICR小鼠随机分为：生理盐水对照组、模型组、七味姜黄搽剂组、复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量治疗组，n=6。小鼠耳廓内注射P.acnes致炎24h，各组行生理盐水、七味姜黄搽剂、复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量涂抹治疗，持续治疗7 d。记录耳廓厚度及形态学变化，行常规HE染色，实时荧光定量PCR法检测组织NLRP3、caspase-1、IL-1β的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹法检测TLR2等相关蛋白表达水平。结果 复方桑叶消痤凝胶能对痤疮炎症起一定改善作用，减轻表皮脊层增生，皮损中炎症小体相关因子NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA表达降低，皮损中TLR2、NLRP3、caspase-1蛋白表达降低。 结论 复方桑叶消痤凝胶减轻了痤疮模型小鼠的炎症，这种炎症改善作用可能受NLRP3炎性小体信号通路调控。
关键词：复方桑叶消痤凝胶;NLRP3炎性小体;ICR小鼠痤疮模型
中图分类号：R758.73+3 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）11-0065-06
A Preliminary Study on the Inflammation Improvement Effect and Anti-inflammatory Mechanism of Compound Sangye Xiaocuo Gel on ICR Mice with Acne Model
CHEN Qian1， JIANG Yang1， LV Jing1， HUANG Xianzhi2
（1. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine/Chongqing First People's Hospital， Chongqing 400011， China;2. Department of Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400000， China）
【Abstract】Objective： To explore the anti-inflammatory effect of Compound Sangye Xiaocuo Gel on ICR mouse acne model. Methods： Female ICR mice aged 6-8 weeks were randomly divided into normal saline control group， model group， seven-flavored turmeric liniment group， Compound Sangye Xiaocuo Gel groups of high， medium and low doses， n=6. The mice were injected with P.acnes into the auricle to cause inflammation for 24 hours， and each group was treated with normal saline， seven-flavored turmeric liniment， Compound Sangye Xiaocuo Gel of high， medium and low doses， and the treatment lasted for 7 days. The thickness and morphological changes of the auricle were recorded， and conventional HE staining was performed. The mRNA expression levels of NLRP3， caspase-1 and IL-1β in tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and the expression levels of TLR2 and other related proteins were detected by western blotting. Results： Compound Sangye Xiaocuo Gel can improve acne inflammation， reduce epidermal spine hyperplasia， and lower inflammasome-related factors of NLRP3， caspase-1， IL-1β mRNA expression in skin lesions and the protein expression of TLR2， NLRP3 and Caspase-1 in skin lesions. Conclusion： Compound Sangye Xiaocuo Gel has reduced the inflammation in acne model mice， and this inflammation improvement effect may be regulated by the NLRP3 inflammasome signaling pathway.
【Key words】Compound Sangye Xiaocuo Gel; NLRP3 inflammasome; ICR Mouse Model of Acne
痤疮是一种以粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿为表现的毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，可导致部分患者严重瘢痕，极大地影响患者容貌及身心健康[1-3]。痤疮发病因素复杂且发病率高，我国几项痤疮流行病学调查的结果显示[4]，中小学生痤疮发病率可达50%，作息不规律的大学生发病率可高达80%。痤疮丙酸杆菌（P.acnes）为诱发痤疮炎症的重要因素之一，作为正常皮肤菌群的一员，P.acnes在痤疮患者的毛囊皮脂腺却是明显增加[5]。近年來，较多研究指出，TLR2 信号通路介导了P.acnes诱导机体的免疫应答[6-7]，同时相关报道也指出，除了TLR2 信号通路外，其他通路途径也参与了痤疮的炎症过程，近几年越来越多的报道指出NLRP3炎性小体也参与其中。NLRP3炎症小体是固有免疫系统识别受体家族重要成员之一，较多研究证明其参与了多种皮肤病的炎症过程，P.acnes在人皮脂腺细胞、单核细胞/巨噬细胞中均能激活NLRP3炎性小体，通过自活化激活caspase-1后，进一步剪切IL-1β前体，使IL-1β成熟及分泌，进而引起机体一系列炎症反应[8-9]。 本院自制的中药制剂复方桑叶消痤凝胶，主要成分为桑叶、柿叶、川芎。本复方中，桑叶始载于《神农本草经》，其性寒，味甘、苦，具有降血压、血脂以及抑菌抗炎的作用。柿叶做药用首载于《滇南本草》，其味苦，性寒，具有清热解毒，润肺活血功效。川芎亦始记于《神农本草经》，其具有活血化瘀，祛风止痛之功效。故本中药复方三药配伍共奏疏风清热、凉血活血和散结消肿之功。该方前期临床应用效果良好，涂抹于于面部直达病所，但具体作用机制尚未探索。
本次研究利用痤疮丙酸杆菌建立ICR小鼠痤疮模型，通过观察我院自制复方桑叶消痤凝胶对ICR小鼠痤疮模型炎性改善作用，初步探究其对TLR2/NLRP3炎性小体及下游炎症相关因子Caspase-1和IL-1β的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂 蛋白电泳仪及酶标仪购买于BIO-RED，荧光定量PCR仪购买于瑞士罗氏公司，电泳相关基础试剂及β-actin抗体均购买于碧云天生物技术有限公司，ECL化学发光试剂盒（sb-wb012）购买于圣尔生物，SYBR Premix Ex TaqTM（04707516001）、RT-PCR逆转录试剂盒（04897030001）购买于瑞士罗氏公司，TLR2（ab209216）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab138483）等一抗购买于abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗购买于联科生物公司，所有引物均由擎科生物科技有限公司合成。
1.2 实验药物 阳性药：七味姜黄搽剂（贵州双升制药有限公司生产）。复方桑叶消痤凝胶制剂（桑叶、柿叶、川芎烘干超微粉碎过300目筛），凝胶高剂量组为柿叶∶川芎∶桑叶浓缩粉比例1∶1∶2;复方桑叶消痤凝胶中劑量组为柿叶∶川芎∶桑叶浓缩粉比例1∶1∶1;复方桑叶消痤凝胶低剂量组为柿叶∶川芎∶桑叶浓缩粉比例1∶1∶0.5。柿叶，川芎，桑叶等份配比熬制后提炼制成凝胶。
1.3 实验动物 雌性ICR小鼠36只，6～8周龄，30～40 g，由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供（许可证号：SCXK-（渝）2017-0006）。
1.4 造模及治疗
1.4.1 痤疮丙酸杆菌混悬液制备 痤疮丙酸杆菌购买于中国药品生物制品检定所（编码：ATCC6919），取1株菌株于脑心浸液培养基中37℃转种活化并厌氧培养增殖，用PBS配制浓度为5×106CFU/μl菌液，备用。
1.4.2 分组及造模 ICR小鼠随机分为6组：生理盐水对照组，模型组，七味姜黄搽剂组（阳性组），复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量治疗组，每组6只。除对照组外，其余各组共30只小鼠，每只小鼠左耳内侧面耳注射一次痤疮丙酸杆菌混悬液20ul（5×106CFU/μl），24 h后，可见鼠耳明显增厚，毛囊口毛孔扩大明显，挤压可见白色内容物，可见P.acnes囊肿，类似于炎症性痤疮。
1.4.3 实验方法 除生理盐水对照组外，其余各组动物在造模范围用棉签涂抹各组对应药物，每日早晚 2 次，连续给药7 d为1个疗程。其中复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组每次涂抹厚度约为1～2 mm，无需清洗，小鼠自身活动会逐渐蹭掉。结束干预后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，取材，备用。
1.5 检测指标及方法
1.5.1 形态学观察及耳廓厚度记录 各组小鼠干预前后，肉眼观察并拍照记录小鼠耳部炎症、脓疱、红肿等。利用千分尺记录造模前后及治疗期间小鼠耳廓皮损厚度，测量时均选择皮损处同一位置同一力度进行测量，重复3次，记录测量数据。
1.5.2 组织病理切片HE染色 皮损组织经多聚甲醛液固定、30%蔗糖溶液脱水、石蜡包埋、切片（厚6um）、行 Hematoxylin-Eosin染色，光学显微镜拍照。
1.5.3 Real-time PCR 组织总RNA获取采用常规TRIZOL法，并进一步用ROCHE试剂盒逆转录成cDNA。Real-time PCR的反应体系为：SYBR TaqII（2×）5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，cDNA 1ul，dH2O 3ul，总体积为10ul。 Real-time PCR程序为：95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30s，总循环数为40;溶解曲线95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃ 1s，冷却40℃ 10s。下表1为引物上下游碱基序列。
1.5.4 Western blot 组织总蛋白提取及制备，电泳分离（电压先80V分离0.5h后，再调至120V分离约1.5h），蛋白膜转移（电压100V转移时间1h），脱脂牛奶封闭1h后加入合适稀释度的一抗（TLR2、NLRP3、Caspase-1、β-actin），4℃冰箱孵育过夜，加TBST，于摇床洗膜3次每次10 min，合适浓度的二抗1h，重复TBST洗膜3次每次10 min，显色。ImageJ软件测量目的蛋白条带灰度值。
1.6 统计学方法 采用SPSS l 9.0统计软件对数据进行统计学分析，运用多个样本均数比较的方差分析检验，数据以表示，组间差异采用单因素方差分析。P<0.05表示具有统计学意义。
2 结果
2.1 ICR小鼠耳部痤疮模型建立及肿胀情况 见图1。生理盐水对照组小鼠耳薄、光滑呈半透明状，可见毛细血管;注射P.acnes造模后，各组耳部均出现明显红肿，注射部位形成皮丘脓疱。模型组1周后耳廓脓肿仍然持续，部分表面破溃结痂;七味姜黄搽剂组给药1周后耳廓炎症相较模型组呈明显减轻状，耳廓脓肿、脓疱及丘疹等大部分吸收;复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组治疗后炎症、脓肿均有不同程度减轻，内耳阔逐渐恢复平滑光泽，且高剂量组肉眼可见肿胀改善相对明显。
2.2 各组ICR小鼠耳廓厚度及组织病理改变 各组在注射P.acnes致炎24h后，耳廓均出现明显的增厚，且各组随着时间的增加厚度呈现不同程度降低趋势，其中模型组小鼠耳廓平均厚度下降较为缓慢，阳性对照组及复方桑叶消痤凝胶高中低组疗后耳廓平均厚度下降更为迅速，以高剂量组疗效最明显。具体数据见图2。耳部组织石蜡切片后，行HE染色，生理盐水对照组小鼠耳廓的表皮、毛囊及真皮等均未见明显异常的病理变化。模型组表皮厚度增加，真皮内炎症细胞浸润增多且呈弥散状，间质充血水肿，同时皮脂腺增生显著;七味姜黄搽剂组及复方桑叶消痤凝胶高剂量组耳部真皮内炎症细胞浸润明显减少，组织水肿减轻，真皮上部散在少许皮脂腺腺体;复方桑叶消痤凝胶中、低剂量组表皮增厚情况减轻，炎症细胞浸润、组织水肿及皮脂腺增生相较于模型组均有缓解，见图3。 2.3 Real-time PCR检测结果与模型组相比，七味姜黄搽剂组，复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组NLRP3、IL-1β mRNA表达水平均明显下降，（P<0.001）;相较模型组，七味姜黄搽剂组，复方桑叶消痤凝胶高、中剂量组Caspase-1表达明显降低（P<0.001），但复方桑叶消痤凝胶低剂量组与模型组没有明显差异。见表2。
2.4 Western blot检测结果与模型组相比，七味姜黄搽剂组，复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组TLR2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达水平均明显下降（P<0.001），见表3及图4。
3 讨论
痤疮发病因素极其复杂，是多种因素共同作用的结果，包括Toll样受体、白介素、肿瘤坏死因子等多种促炎因子、趋化因子参与其炎症过程。体表出现痤疮病变的主要因素之一就在于毛囊皮脂腺中痤疮丙酸杆菌（P.acnes）的过度增殖[5]。P.acnes是正常寄生于皮肤的菌群之一典型的革兰氏阳性厌氧菌。大量研究表明，在痤疮患者毛囊皮脂腺中，P.acnes数量明显增高。Sunhyo Ryu等[10]通过建立ICR小鼠耳廓痤疮模型，即于耳廓皮内注射P.acnes，24 h后，耳廓出现严重的红斑肿胀，表现出典型的炎症症状。进一步研究表明，P.acnes诱导小鼠耳廓痤疮模型后，炎症相关因子TNF-α和IL-1β的表达明显增加[11]。
在痤疮的炎症、免疫反应过程中，TLR2信号通路一直是研究的热点。研究表明，痤疮患者外周血單核细胞TLR2表达水平较正常志愿者明显增高，且IL-1β、IL-6等促炎因子也呈高表达，进一步经异维A酸治疗1周后，TLR2及上述细胞因子的分泌显著降低[12]。痤疮患者P.acnes大量增殖后，经TLR2信号通路可产生一系列炎症相关因子，触发机体炎症反应，研究者发现利用抗-TLR2中和抗体对此炎症反应起到一定阻断作用，但并不能将其完全阻断，阻断作用大约为50%～60%。因此推断存在其他信号通路和TLR2信号通路一起参与P.acnes诱导机体免疫应答过程[13]。近来研究显示NLR（NOD-like receptors）也参与了痤疮的炎症过程[14-15]，NLRP3属于NLRs家族，可以与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及含胱天蛋白酶1 前体（pro-caspase-1）形成一种多蛋白复合体，称炎性小体，炎性小体可以使pro-caspase-1自身剪切为活化的Caspase-1，Caspase-1作为效应分子可以进一步将IL-1β前体剪接成成熟的IL-1β，而大量成熟的IL-1β的分泌则进一步导致炎症相关疾病发生[16]。已有研究证实痤疮患者皮损中NLRP3、Caspase-1及IL-1β较正常人增多;P.acnes诱导激活NLRP3炎性小体，成熟的Caspase-1，诱导IL-1β细胞因子大量分泌，研究人员进一步通过基因沉默NLRP3炎性小体相关因子后，可以明显抑制IL-1β的产生，通过靶向阻断疗法成功的减轻了P.acnes诱导的相关炎症[17-19]。由此可见，NLRP3炎性小体也参与P.acnes诱导机体免疫应答的过程。
痤疮在中医属“粉刺”或“肺风粉刺”的范畴，治疗则多以清泻肺胃之热、活血消肿散结为主[20-22]。陈福君等[23]通过探索桑叶的抗炎，证实桑叶具有显著抑制由巴豆油导致的小鼠耳廓肿胀的疗效，也能抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，减轻角叉菜胶所致的小鼠足跖浮肿。说明桑叶具有一定的抗炎作用，故对治疗以炎症为特点的痤疮可能具有良好的作用。杨建雄等[24]研究发现柿叶黄酮有明显的体外抗氧化作用。Sun等[25]实验证实柿叶总黄酮的抗氧化活性和抗过氧化物阴离子、羟基自由基和金属螯合物的活性明显强于芦丁强。川芎能有效改善微循环、抑制肿胀。综上，本凝胶制剂由桑叶柿叶及川芎制备而成，兼具抗菌、消炎、抗氧化、改善循坏，可对抑制痤疮的炎症起一定作用。
本研究建立小鼠痤疮模型，经复方桑叶消痤凝胶进行干预治疗，HE染色可见，复方桑叶消痤凝胶能减轻痤疮模型的炎症，改善表皮脊层增生;Real-time显示皮损中NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA表达降低;western blot显示皮损中TLR2、NLRP3、caspase-1蛋白表达降低。复方桑叶消痤凝胶对痤疮小鼠的炎症反应起到明显的抑制作用，该作用机理可能是通过TLR2通路抑制了痤疮的炎症，同时协同抑制NLRP3炎性小体的激活。本实验针对复方桑叶消痤凝胶对TLR2、NLRP3、caspase-1、IL-1β的影响进行了初探，旨在探索复方桑叶消痤凝胶治疗痤疮的作用机制，但痤疮发病机制十分复杂，涉及到多条信号通路的共同作用，其中TLR2信号通路及NLRP3炎性小体是究竟通过何种协同作用参与痤疮炎症的抑制值得持续深入探索。
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（收稿日期：2021-08-27）
关键词：复方桑叶消痤凝胶;NLRP3炎性小体;ICR小鼠痤疮模型
中图分类号：R758.73+3 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）11-0065-06
A Preliminary Study on the Inflammation Improvement Effect and Anti-inflammatory Mechanism of Compound Sangye Xiaocuo Gel on ICR Mice with Acne Model
CHEN Qian1， JIANG Yang1， LV Jing1， HUANG Xianzhi2
（1. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine/Chongqing First People's Hospital， Chongqing 400011， China;2. Department of Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400000， China）
【Abstract】Objective： To explore the anti-inflammatory effect of Compound Sangye Xiaocuo Gel on ICR mouse acne model. Methods： Female ICR mice aged 6-8 weeks were randomly divided into normal saline control group， model group， seven-flavored turmeric liniment group， Compound Sangye Xiaocuo Gel groups of high， medium and low doses， n=6. The mice were injected with P.acnes into the auricle to cause inflammation for 24 hours， and each group was treated with normal saline， seven-flavored turmeric liniment， Compound Sangye Xiaocuo Gel of high， medium and low doses， and the treatment lasted for 7 days. The thickness and morphological changes of the auricle were recorded， and conventional HE staining was performed. The mRNA expression levels of NLRP3， caspase-1 and IL-1β in tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and the expression levels of TLR2 and other related proteins were detected by western blotting. Results： Compound Sangye Xiaocuo Gel can improve acne inflammation， reduce epidermal spine hyperplasia， and lower inflammasome-related factors of NLRP3， caspase-1， IL-1β mRNA expression in skin lesions and the protein expression of TLR2， NLRP3 and Caspase-1 in skin lesions. Conclusion： Compound Sangye Xiaocuo Gel has reduced the inflammation in acne model mice， and this inflammation improvement effect may be regulated by the NLRP3 inflammasome signaling pathway.
【Key words】Compound Sangye Xiaocuo Gel; NLRP3 inflammasome; ICR Mouse Model of Acne
痤疮是一种以粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿为表现的毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，可导致部分患者严重瘢痕，极大地影响患者容貌及身心健康[1-3]。痤疮发病因素复杂且发病率高，我国几项痤疮流行病学调查的结果显示[4]，中小学生痤疮发病率可达50%，作息不规律的大学生发病率可高达80%。痤疮丙酸杆菌（P.acnes）为诱发痤疮炎症的重要因素之一，作为正常皮肤菌群的一员，P.acnes在痤疮患者的毛囊皮脂腺却是明显增加[5]。近年來，较多研究指出，TLR2 信号通路介导了P.acnes诱导机体的免疫应答[6-7]，同时相关报道也指出，除了TLR2 信号通路外，其他通路途径也参与了痤疮的炎症过程，近几年越来越多的报道指出NLRP3炎性小体也参与其中。NLRP3炎症小体是固有免疫系统识别受体家族重要成员之一，较多研究证明其参与了多种皮肤病的炎症过程，P.acnes在人皮脂腺细胞、单核细胞/巨噬细胞中均能激活NLRP3炎性小体，通过自活化激活caspase-1后，进一步剪切IL-1β前体，使IL-1β成熟及分泌，进而引起机体一系列炎症反应[8-9]。 本院自制的中药制剂复方桑叶消痤凝胶，主要成分为桑叶、柿叶、川芎。本复方中，桑叶始载于《神农本草经》，其性寒，味甘、苦，具有降血压、血脂以及抑菌抗炎的作用。柿叶做药用首载于《滇南本草》，其味苦，性寒，具有清热解毒，润肺活血功效。川芎亦始记于《神农本草经》，其具有活血化瘀，祛风止痛之功效。故本中药复方三药配伍共奏疏风清热、凉血活血和散结消肿之功。该方前期临床应用效果良好，涂抹于于面部直达病所，但具体作用机制尚未探索。
本次研究利用痤疮丙酸杆菌建立ICR小鼠痤疮模型，通过观察我院自制复方桑叶消痤凝胶对ICR小鼠痤疮模型炎性改善作用，初步探究其对TLR2/NLRP3炎性小体及下游炎症相关因子Caspase-1和IL-1β的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂 蛋白电泳仪及酶标仪购买于BIO-RED，荧光定量PCR仪购买于瑞士罗氏公司，电泳相关基础试剂及β-actin抗体均购买于碧云天生物技术有限公司，ECL化学发光试剂盒（sb-wb012）购买于圣尔生物，SYBR Premix Ex TaqTM（04707516001）、RT-PCR逆转录试剂盒（04897030001）购买于瑞士罗氏公司，TLR2（ab209216）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab138483）等一抗购买于abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗购买于联科生物公司，所有引物均由擎科生物科技有限公司合成。
1.2 实验药物 阳性药：七味姜黄搽剂（贵州双升制药有限公司生产）。复方桑叶消痤凝胶制剂（桑叶、柿叶、川芎烘干超微粉碎过300目筛），凝胶高剂量组为柿叶∶川芎∶桑叶浓缩粉比例1∶1∶2;复方桑叶消痤凝胶中劑量组为柿叶∶川芎∶桑叶浓缩粉比例1∶1∶1;复方桑叶消痤凝胶低剂量组为柿叶∶川芎∶桑叶浓缩粉比例1∶1∶0.5。柿叶，川芎，桑叶等份配比熬制后提炼制成凝胶。
1.3 实验动物 雌性ICR小鼠36只，6～8周龄，30～40 g，由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供（许可证号：SCXK-（渝）2017-0006）。
1.4 造模及治疗
1.4.1 痤疮丙酸杆菌混悬液制备 痤疮丙酸杆菌购买于中国药品生物制品检定所（编码：ATCC6919），取1株菌株于脑心浸液培养基中37℃转种活化并厌氧培养增殖，用PBS配制浓度为5×106CFU/μl菌液，备用。
1.4.2 分组及造模 ICR小鼠随机分为6组：生理盐水对照组，模型组，七味姜黄搽剂组（阳性组），复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量治疗组，每组6只。除对照组外，其余各组共30只小鼠，每只小鼠左耳内侧面耳注射一次痤疮丙酸杆菌混悬液20ul（5×106CFU/μl），24 h后，可见鼠耳明显增厚，毛囊口毛孔扩大明显，挤压可见白色内容物，可见P.acnes囊肿，类似于炎症性痤疮。
1.4.3 实验方法 除生理盐水对照组外，其余各组动物在造模范围用棉签涂抹各组对应药物，每日早晚 2 次，连续给药7 d为1个疗程。其中复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组每次涂抹厚度约为1～2 mm，无需清洗，小鼠自身活动会逐渐蹭掉。结束干预后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，取材，备用。
1.5 检测指标及方法
1.5.1 形态学观察及耳廓厚度记录 各组小鼠干预前后，肉眼观察并拍照记录小鼠耳部炎症、脓疱、红肿等。利用千分尺记录造模前后及治疗期间小鼠耳廓皮损厚度，测量时均选择皮损处同一位置同一力度进行测量，重复3次，记录测量数据。
1.5.2 组织病理切片HE染色 皮损组织经多聚甲醛液固定、30%蔗糖溶液脱水、石蜡包埋、切片（厚6um）、行 Hematoxylin-Eosin染色，光学显微镜拍照。
1.5.3 Real-time PCR 组织总RNA获取采用常规TRIZOL法，并进一步用ROCHE试剂盒逆转录成cDNA。Real-time PCR的反应体系为：SYBR TaqII（2×）5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，cDNA 1ul，dH2O 3ul，总体积为10ul。 Real-time PCR程序为：95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30s，总循环数为40;溶解曲线95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃ 1s，冷却40℃ 10s。下表1为引物上下游碱基序列。
1.5.4 Western blot 组织总蛋白提取及制备，电泳分离（电压先80V分离0.5h后，再调至120V分离约1.5h），蛋白膜转移（电压100V转移时间1h），脱脂牛奶封闭1h后加入合适稀释度的一抗（TLR2、NLRP3、Caspase-1、β-actin），4℃冰箱孵育过夜，加TBST，于摇床洗膜3次每次10 min，合适浓度的二抗1h，重复TBST洗膜3次每次10 min，显色。ImageJ软件测量目的蛋白条带灰度值。
1.6 统计学方法 采用SPSS l 9.0统计软件对数据进行统计学分析，运用多个样本均数比较的方差分析检验，数据以表示，组间差异采用单因素方差分析。P<0.05表示具有统计学意义。
2 结果
2.1 ICR小鼠耳部痤疮模型建立及肿胀情况 见图1。生理盐水对照组小鼠耳薄、光滑呈半透明状，可见毛细血管;注射P.acnes造模后，各组耳部均出现明显红肿，注射部位形成皮丘脓疱。模型组1周后耳廓脓肿仍然持续，部分表面破溃结痂;七味姜黄搽剂组给药1周后耳廓炎症相较模型组呈明显减轻状，耳廓脓肿、脓疱及丘疹等大部分吸收;复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组治疗后炎症、脓肿均有不同程度减轻，内耳阔逐渐恢复平滑光泽，且高剂量组肉眼可见肿胀改善相对明显。
2.2 各组ICR小鼠耳廓厚度及组织病理改变 各组在注射P.acnes致炎24h后，耳廓均出现明显的增厚，且各组随着时间的增加厚度呈现不同程度降低趋势，其中模型组小鼠耳廓平均厚度下降较为缓慢，阳性对照组及复方桑叶消痤凝胶高中低组疗后耳廓平均厚度下降更为迅速，以高剂量组疗效最明显。具体数据见图2。耳部组织石蜡切片后，行HE染色，生理盐水对照组小鼠耳廓的表皮、毛囊及真皮等均未见明显异常的病理变化。模型组表皮厚度增加，真皮内炎症细胞浸润增多且呈弥散状，间质充血水肿，同时皮脂腺增生显著;七味姜黄搽剂组及复方桑叶消痤凝胶高剂量组耳部真皮内炎症细胞浸润明显减少，组织水肿减轻，真皮上部散在少许皮脂腺腺体;复方桑叶消痤凝胶中、低剂量组表皮增厚情况减轻，炎症细胞浸润、组织水肿及皮脂腺增生相较于模型组均有缓解，见图3。 2.3 Real-time PCR检测结果与模型组相比，七味姜黄搽剂组，复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组NLRP3、IL-1β mRNA表达水平均明显下降，（P<0.001）;相较模型组，七味姜黄搽剂组，复方桑叶消痤凝胶高、中剂量组Caspase-1表达明显降低（P<0.001），但复方桑叶消痤凝胶低剂量组与模型组没有明显差异。见表2。
2.4 Western blot检测结果与模型组相比，七味姜黄搽剂组，复方桑叶消痤凝胶高、中、低剂量组TLR2、NLRP3、caspase-1 蛋白表达水平均明显下降（P<0.001），见表3及图4。
3 讨论
痤疮发病因素极其复杂，是多种因素共同作用的结果，包括Toll样受体、白介素、肿瘤坏死因子等多种促炎因子、趋化因子参与其炎症过程。体表出现痤疮病变的主要因素之一就在于毛囊皮脂腺中痤疮丙酸杆菌（P.acnes）的过度增殖[5]。P.acnes是正常寄生于皮肤的菌群之一典型的革兰氏阳性厌氧菌。大量研究表明，在痤疮患者毛囊皮脂腺中，P.acnes数量明显增高。Sunhyo Ryu等[10]通过建立ICR小鼠耳廓痤疮模型，即于耳廓皮内注射P.acnes，24 h后，耳廓出现严重的红斑肿胀，表现出典型的炎症症状。进一步研究表明，P.acnes诱导小鼠耳廓痤疮模型后，炎症相关因子TNF-α和IL-1β的表达明显增加[11]。
在痤疮的炎症、免疫反应过程中，TLR2信号通路一直是研究的热点。研究表明，痤疮患者外周血單核细胞TLR2表达水平较正常志愿者明显增高，且IL-1β、IL-6等促炎因子也呈高表达，进一步经异维A酸治疗1周后，TLR2及上述细胞因子的分泌显著降低[12]。痤疮患者P.acnes大量增殖后，经TLR2信号通路可产生一系列炎症相关因子，触发机体炎症反应，研究者发现利用抗-TLR2中和抗体对此炎症反应起到一定阻断作用，但并不能将其完全阻断，阻断作用大约为50%～60%。因此推断存在其他信号通路和TLR2信号通路一起参与P.acnes诱导机体免疫应答过程[13]。近来研究显示NLR（NOD-like receptors）也参与了痤疮的炎症过程[14-15]，NLRP3属于NLRs家族，可以与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及含胱天蛋白酶1 前体（pro-caspase-1）形成一种多蛋白复合体，称炎性小体，炎性小体可以使pro-caspase-1自身剪切为活化的Caspase-1，Caspase-1作为效应分子可以进一步将IL-1β前体剪接成成熟的IL-1β，而大量成熟的IL-1β的分泌则进一步导致炎症相关疾病发生[16]。已有研究证实痤疮患者皮损中NLRP3、Caspase-1及IL-1β较正常人增多;P.acnes诱导激活NLRP3炎性小体，成熟的Caspase-1，诱导IL-1β细胞因子大量分泌，研究人员进一步通过基因沉默NLRP3炎性小体相关因子后，可以明显抑制IL-1β的产生，通过靶向阻断疗法成功的减轻了P.acnes诱导的相关炎症[17-19]。由此可见，NLRP3炎性小体也参与P.acnes诱导机体免疫应答的过程。
痤疮在中医属“粉刺”或“肺风粉刺”的范畴，治疗则多以清泻肺胃之热、活血消肿散结为主[20-22]。陈福君等[23]通过探索桑叶的抗炎，证实桑叶具有显著抑制由巴豆油导致的小鼠耳廓肿胀的疗效，也能抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，减轻角叉菜胶所致的小鼠足跖浮肿。说明桑叶具有一定的抗炎作用，故对治疗以炎症为特点的痤疮可能具有良好的作用。杨建雄等[24]研究发现柿叶黄酮有明显的体外抗氧化作用。Sun等[25]实验证实柿叶总黄酮的抗氧化活性和抗过氧化物阴离子、羟基自由基和金属螯合物的活性明显强于芦丁强。川芎能有效改善微循环、抑制肿胀。综上，本凝胶制剂由桑叶柿叶及川芎制备而成，兼具抗菌、消炎、抗氧化、改善循坏，可对抑制痤疮的炎症起一定作用。
本研究建立小鼠痤疮模型，经复方桑叶消痤凝胶进行干预治疗，HE染色可见，复方桑叶消痤凝胶能减轻痤疮模型的炎症，改善表皮脊层增生;Real-time显示皮损中NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA表达降低;western blot显示皮损中TLR2、NLRP3、caspase-1蛋白表达降低。复方桑叶消痤凝胶对痤疮小鼠的炎症反应起到明显的抑制作用，该作用机理可能是通过TLR2通路抑制了痤疮的炎症，同时协同抑制NLRP3炎性小体的激活。本实验针对复方桑叶消痤凝胶对TLR2、NLRP3、caspase-1、IL-1β的影响进行了初探，旨在探索复方桑叶消痤凝胶治疗痤疮的作用机制，但痤疮发病机制十分复杂，涉及到多条信号通路的共同作用，其中TLR2信号通路及NLRP3炎性小体是究竟通过何种协同作用参与痤疮炎症的抑制值得持续深入探索。
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（收稿日期：2021-08-27）