论文部分内容阅读
摘要 目的：通过运用网络药理学方法来探究“黄芪-白术”治疗功能性便秘（FC）的可能机制。方法：运用网络数据库对黄芪-白术药对有效成分及FC靶点进行检索筛选。运用作图软件构建“黄芪-白术”药对的“成分-靶点”网络图。利用STRING数据库构建黄芪-白术药对治疗便秘的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，拓扑分析出核心靶点。最后，通过Metascape数据库对药物-疾病公共靶点进行生物过程及通路富集分析。结果：在黄芪-白术药对中共筛选出27个与FC相关的有效成分和497个潜在作用靶点;拓扑分析得到16个核心靶点;富集分析得到20条富集结果，其中基因本体论（GO）生物过程的细胞对激素刺激的反应上靶点富集数目最多。结论：黄芪-白术药对治疗FC具有多成分、多靶点、多途径的特点，其机制可能主要通过对细胞对激素刺激反应的调控来实现，也提示该通路是未来研究黄芪-白术药对治疗FC机制的重要方向。
关键词 网络药理学;黄芪-白术;药对;功能性便秘;机制研究
Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Astragalus membranaceus-Atractylodes macrocephala in the treatment of functional constipation（FC）by network pharmacology.Methods：The effective components and FC targets of Astragalus membranaceus and Atractylodes macrocephala drug pair were searched and screened by using network database.By using STRING database to construct protein interaction network（PPI）of Astragalus membranaceus-Atractylodes macrocephala drug pair for constipation treatment，the core targets were topologically analyzed.Finally，bioprocess and pathway enrichment analysis of drug-disease public targets was made through Metascape database.Results：A total of 27 FC-related active ingredients and 497 potential targets were screened out from the Astragalus-Atractylodes macrocephala drug pair.By topological analysis，16 core targets were obtained.A total of 20 enrichment results were obtained by enrichment analysis.Among them，GO（gene ontology，GO）biological process cells had the largest number of targets enriched in cellular response to hormone stimulus（cellular response to hormone stimulus）.Conclusion：Astragalus-Atractylodes macrocephala drug pair is multi-component，multi-target and multi-channel in the treatment of FC，and its mechanism may be mainly realized through the regulation of cell response to hormone stimulation.It also suggests that this pathway is an important direction for future research on the mechanism of Astragalus-Atractylodes Macrocephala drug in the treatment of FC.
Keywords Network pharmacology; Astragalus-Atractylodes Macrocephala; Drug pair; Functional Constipation; Mechanism research
中圖分类号：R242;R574文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.003
功能性便秘（Functional Constipation，FC）是便秘的常见类型，其临床表现主要为排便费力，排便次数减少，排便不尽感等，其发病因素与排除明确的药物性因素和肠道器质性因素等因素有关[1]。FC是一种临床常见病，多发病，在女性和中老年人中发病率更高[2]。黄芪-白术药对治疗功能性便秘效果确切，并有广泛运用，但其具体作用成分和作用靶点尚未见到相关报道。最近几年，网络药理学为研究中药药效的具体作用机制提供了思路，因其具有以“疾病、基因、药物、靶点”为基础的特色[3]。我们拟通过网络药理学的方法筛选黄芪-白术有效成分，确定疾病作用靶点，为进一步分析其治疗功能性便秘机制提供循证依据。
1 资料与方法 1.1 黄芪-白术有效成分挖掘 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库以“huangqi”“baizhu”为关键词进行检索;按口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18条件筛选中药成分。
1.2 黄芪-白术有效成分靶点预测 在TCMSP数据库中查询黄芪、白术有效成分对应的靶点蛋白，并导入Unitprot数据库查询蛋白的基因名称，同时进行基因名标准化处理。
1.3 FC疾病的靶点预测 分别在Drugbank数据库（www.drugbank.ca/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）中，以关键词“Functional constipation”进行检索，收集功能性便秘相关的靶点基因，并查阅文献进行补充遗漏靶点信息;然后导入Uniprot数据库进行基因名标准化处理，并进行整理归纳。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图的构建与分析 先将黄芪、白术有效成分作用靶点进行去重，再与FC靶点组建“成分-疾病”靶点数据库，取二者交集，组成“成分-疾病”映射文件，即寻找成分与疾病共有的靶点。利用交集出的共有靶点与化合物成分，通过STRING数据库建立“黄芪、白术-便秘靶点”的PPI网络。利用Cytoscape软件对靶点蛋白互作网络以连接度（Dregree=6.73）进行筛选，拓扑分析得到靶点核心网络图。
1.5 生物通路及富集分析 利用Metascape数据库针对“药物-疾病”公共靶点进行生物功能和通路的富集分析，根据富集结果对“黄芪-白术”治疗便秘的机制进行预测。
2 结果
2.1 “黄芪-白术”的有效成分收集和筛选 通过运用TCMSP数据库，以“黄芪”“白术”为关键词进行成分搜索，共得到药物有效成分144个，其中白术56个，黄芪88个;基于药代动力学参数（ADME），按照口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18条件，进行有效性筛选，同时查阅文献进行补充，共得到“黄芪-白术”有效成分27个，其中黄芪20个，白术7个。见表1。由结果得知“黄芪-白术”有效成分主要包含黄酮类、萜类、脂类等;其中具有良好的OB和DL值有：Isoflavanone（异黄烷酮）、Mairin（丁子香萜）、α-Amyrin（α-香树精）、Hederagenin（常春藤皂苷元）等等。由此可以推测黄芪-白术药对具有多成分的药理特点。
2.2 “黄芪-白术”有效成分靶点预测与成分-靶点关系网络图的构建 利用TCMSP数据库，将“黄芪-白术”27个有效成分在数据库内进行检索，获取其有效成分的对应靶点，共496个。并将其导入Unitprot数据库（http：//www.Unitprot.org/）进行基因名标准化处理，再通过Cytoscape3.7.2软件构建“黄芪白术-有效成分-靶点”网络图。见图1。该图由162个节点组成，红色菱形符号代表中药名，蓝色三角形符号代表有效成分，绿色“V”字形符号代表有效成分所对应的靶点，节点与节点之间的边表示成分与靶点之间的相互作用关系，平均自由度6.45，最大自由度88，最小自由度1。
2.3 疾病靶点信息的收集 在Drugbank、TTD、GeneCards数据库中以“Functional constipation”为关键词进行数据搜索。以“Relevance score>7”进行筛选，共寻找到靶点基因463个。其中Drugbank 51个、TTD 12个、GeneCards 400个。将以上数据库合并整理后并导入Uniprot数据库进行基因标准化处理，再以Uniprot ID為标准，利用EXCEL表格的“删除重复值”功能，对数据进行去重，最终筛选得到疾病靶点342个;通过Cytoscape3.7.2软件构建FC“疾病-靶点”网络图。见图2。
2.4 PPI网络的构建
利用EXCEL表格筛选功能，将463个FC疾病靶点和496个药物有效成分靶点进行合并，取二者交集，得到药物成分和疾病的共有靶点122个。把这122个靶点导入STRING数据库建立起“黄芪、白术-FC靶点”的PPI网络图，再将该结果以STV格式导出，导入Cytoscape3.7.2软件中对该网络进行拓扑分析，以大于平均Degree值6.73为筛选标准，得到16个核心节点。见表2。并构建核心靶点PPI网络图。见图3。结果提示该16个靶点在整个网络中占据重要地位，提示这些靶点可能是黄芪白术发挥药效治疗作用的关键所在。
2.5 生物通路及富集分析
通过Metascape数据库，对药物与疾病公共靶点进行生物功能和通路的富集分析，然后把122个公共靶点输入到该数据库中，筛选背景设定为“Human”进行富集分析，根据靶点富集在通路上的数目以降序原则对通路进行排序。见图4。
图4A、B中，颜色深浅表示不同富集程度，富集程度越高颜色越深。图4C中不同颜色节点表示不同通路。可以看出，黄芪-白术治疗FC的关键靶点主富集在细胞对激素刺激的反应生物过程上最多，其次是PID AR TF通道、细胞对有机环状化合物的反应生物过程、神经活性配体-受体相互作用KEGG通路等。见图4A。由富集结果可以推测，“黄芪-白术”治疗FC具有多通路的特点，其参与机制众多较为复杂，根据公共靶点的富集程度来看，GO生物过程中细胞对激素刺激的反应上靶点富集数目最多;预测治疗FC的机制可能主要通过细胞对激素刺激的反应的调控来实现，也提示该通路是未来研究黄芪-白术药对治疗FC的重要方向。
3 讨论
现代医学认为FC病因病机复杂，发病原因多见心态，性别，年龄，饮食，遗传，知识水平等因素，发病机制多表现为Cajal间质细胞减少，肠道内容物改变，排便动力学改变，肠神经系统改变等。FC不仅病因病机复杂，而且危害严重，治疗困难。长期的FC很容易导致痔疮、肛裂等肛肠疾病的发生，提高胃肠道肿瘤的发病率，加重高血压、心脏病等慢性疾病的临床症状，甚至诱发死亡[4]。现代医学在治疗FC时主要以口服泻药治疗为主，近期通便效果好，但远期效果欠佳，不仅无法治愈便秘，还可能导致结肠黑变病等不良反应。 古代医籍对功能性便秘的记载有“大便难”“不大便”“大便秘”等，直至清代才正式确定“便秘”之名，并沿用至今[5]。中医学认为便秘的发生与多脏腑密切相关，但其主要病位在大肠，可因脾虚失运、胃热炽盛、肺热下移等导致肠道传导失司所致。中医治疗便秘以辨证论治口服中药为主，临床起效虽慢，但毒性及不良反应少，且具有多成分、多靶点等优势。
王永炎[6]将便秘分为气虚型、血虚型、阴虚型、阳虚型、冷秘、热秘、气秘7类，是现今最常用的便秘分型。其中气虚型便秘主因肺脾气虚引起，肺气虚损，宣降失常，脾气虚弱，无以运化，从而导致大肠无力传导糟粕，形成便秘。黄芪归脾经、肺经、有补气升阳，益卫固表之功，白术归脾经、胃经，有补气健脾之功，二者均为补气之要药，同归脾经，切中气虚型便秘病机，二者常相须配伍使用治疗气虚型便秘[7]，如常见的黄芪白术通便汤[8]、补中益气汤[9]、自拟升提固本汤[10]等。有数据挖掘表明，黄芪-白术药对在功能性便秘的运用中高达120次[11]。
研究发现，黄芪的药理作用有协调肠道环境，促进氧化代谢，增强肠道肌肉紧张度等;生白术的药理作用有增加肠道肌肉紧张度和肠道动力等。此外，白术对肠道的作用还与白术的剂量和炮制方法有关[12]，低剂量的白术可以促进肠蠕动，而当剂量到达一定阈值以上，白术反而会抑制胃肠运动[13];生白术因挥发油含量高，可以促进肠蠕动，而炒白术因酯含量高，可以抑制肠蠕动[12]，所以在治療便秘时应选用小剂量生白术与黄芪配伍。肠道动力不只是FC发生的一个重要因素，黄芪、白术可通过增加肠道动力，改善肠道功能，从而达到治疗FC的目的[14-15]。当黄芪-白术药对治疗FC时，其发挥作用的主要靶点是GSK-3β。GSK-3β是一种多功能的氨基酸激酶，当这种酶在脑中高度表达时，与多种神经系统疾病如阿尔茨海默病和双相情感障碍的发生密切相关，而当这种酶在脑肠肽系统中高表达时，又可间接改变胃肠动力[16-17]。CALM3是黄芪-白术药对治疗FC的又一关键靶点，这个靶点其本质是一种蛋白质，因其能与钙离子结合，故又称之为钙调蛋白。有研究表明，钙调蛋白与肠道平滑肌收缩机制密切相关，当钙调蛋白发生变化时，不仅会影响平滑肌正常收缩，还会导致肠道Cajal间质细胞（Imerstitial Cells of Cajal，ICC）自噬过度，从而引起胃肠动力障碍，导致FC的发生[18]。NOS2和NOS3属于NOS的不同类型，其主要区别为NOS对钙是否具有依赖性，当NOS对钙具有依赖性时归于NOS3，当NOS对钙无依赖性时归于NOS2。NOS与NO关系密切，是NO合成中唯一的酶。NO作为一种抑制性神经递质，其在肠神经系统中表达时可以调控胃肠道动力，若NOS水平升高会通过影响NO的表达从而抑制胃肠道动力、影响胃肠道的运动导致FC的发生[19-20]。作为核受体超家族的一员，孕激素受体（Progesterone Receptor，PGR）与孕激素有密不可分的关系，PGR可通过影响孕激素从而导致FC的发生。研究表明，孕激素与1CC有一定关系，当人体孕激素增加时，发现肠道1CC数量减少，发生FC的概率升高[21]。
本研究结果显示，黄芪-白术参与治疗功能性便秘的主要活性物质是黄酮类、萜类、脂类等，其中具有良好OB和DL值的有异黄烷酮（Isoflavanone）、丁子香萜（Mairin）、α-香树精（α-Amyrin）、常春藤皂苷元（Hederagenin）等。国内研究表明，黄酮类成分具有抗癌，抗氧化、促进代谢、抑制焦虑等作用[22]，萜类成分具有抗氧化、抗炎、保护心肌、保护神经等作用[23]，由此推测黄芪-白术可能从缓解神经焦虑情绪，增强机体代谢，促进肠道蠕动等方面治疗FC。
黄芪-白术治疗FC的关键核心靶点GSK3B，CALM3，NOS2，PGR，NOS3等则主要富集在细胞对激素刺激的反应、PID AR TF通道、细胞对有机环状化合物的反应生物过程、神经活性配体-受体相互作用等通路上。神经活性配体-受体相互作用通路意义非凡，它集中了质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体[24]。GSK3B、CALM3、NOS2、PGR、NOS3等核心靶点可以归为激素、有机环状化合物和神经递质等物质，通过对细胞的刺激和反应，从而调节Ca2+，NO，孕激素等，影响ICC数量和脑肠肽系统，达到治疗FC的效果。
综上所述，黄芪-白术药对治疗FC具有多成分、多靶点、多通路的特点，其机制可能主要通过对细胞对激素刺激反应的调控来实现，也提示该通路是未来研究黄芪-白术药对治疗FC机制的重要方向。利用网络药理学平台对黄芪、白术成分靶点及FC疾病靶点进行预测，对临床探究黄芪-白术药对治疗FC机制的研究具有重要意义。
参考文献
[1]王冬冬，吴相柏.功能性便秘的诊治进展[J].中国全科医学，2019，22（24）：3016-3022.
[2]中华医学会消化病学分会胃肠动力学组，中华医学会消化病学分会功能性胃肠病协作组.中国慢性便秘专家共识意见（2019，广州）[J].中华消化杂志，2019，39（9）：577-598.
[3]Hopkins AL.Network pharmacology：the next paradigm in drug discovery[J].Nat Chem Biol，2008，4（11）：682-690.
[4]潘飞辰，沈洪.中医治疗功能性便秘研究进展[J].河南中医，2015，35（7）：1718-1720.
[5]沈金鳖.杂病源流犀烛[M].北京：中国中医药出版社，1991：10.
[6]王永炎.中医内科学[M].上海：上海科学技术出版社，1997：250-251.
[7]林余霖.中国药典中药材及混伪品彩色图谱[M].北京：中医古籍出版社，2017：149，461. [8]王旭峰，胥冬梅.黄芪白术通便汤治疗老年功能性便秘的临床观察[J].中国中医药科技，2018，25（5）：737-738.
[9]朱章帅，蒋开平.蒋开平教授运用补中益气汤临床经验[J].世界中西医结合杂志，2019，14（9）：1244-1246，1315.
[10]苏亮，贾小强，曹威巍，等.升阳固本法论治老年性便秘心得[J].江苏中医药，2019，51（6）：48-49.
[11]何萍萍，范小华，梁学敏，等.中药治疗老年功能性便秘用药规律数据挖掘研究[J].中国中医药信息杂志，2019，26（12）：103-107.
[12]吴翰桂，朱玲，马勇军.白术对小鼠胃肠道活动的影响的实验研究[J].江苏中医药，2005，26（11）：72-73.
[13]冯文林，伍海涛.白术治疗腸道疾病的作用机制探讨[J].辽宁中医杂志，2016，43（1）：125-127.
[14]周萍，周滢.黄芪与白术的配伍机制及临床应用浅析[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（17）：261-263.
[15]李超男，龚雨萍.慢传输型便秘用药规律的文献研究[J].江苏中医药，2018，50（1）：73-75.
[16]Jope RS，Roh MS.Glycogen synthase kinase-3（GSK3）in psychiatric diseases and therapeutic interventions[J].Curr Drug Targets，2006，7（11）：1421-1434.
[17]Mazanetz MP，Fischer PM.Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases[J].Nat Rev Drug Discov，2007，6（6）：464-479.
[18]纪云西，凌江红，庞黎明，等.Cajal间质细胞、细胞自噬与胃肠动力障碍[J].广西医科大学学报，2013，30（3）：485-487.
[19]Tomita R，Igarashi S，Fujisaki S，et al.The effects of neurotensin in the colon of patients with slow transit constipation[J].Hepatogastroenterology，2007，54（78）：1662-1666.
[20]贾蕊，邢海娇，张选平，等.不同刺灸法对功能性便秘大鼠血浆一氧化氮、一氧化氮合酶及结肠血管活性肠肽的影响[J].针刺研究，2017，42（1）：50-55.
[21]付志本，段全红，任斌，等.女性激素与结肠动力学的相关性[J].潍坊医学院学报，2009，31（2）：138-140.
[22]何庆，陈萍萍，李昊，等.黄酮类化合物对CYP1A1酶抑制活性的3D-定量构效关系研究[J].中草药，2021，52（5）：1343-1350.
[23]高佳琪，焦顺刚，马瑾煜，等.丁香属植物中萜类成分研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（10）：2343-2352.
[24]潘玲珍，闫智勇，左长英，等.长期使用地西泮对神经活性配体受体相互作用信号通路的影响[J].中国药科大学学报，2011，42（5）：443-446.
（2020-07-10收稿 责任编辑：杨觉雄）
关键词 网络药理学;黄芪-白术;药对;功能性便秘;机制研究
Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Astragalus membranaceus-Atractylodes macrocephala in the treatment of functional constipation（FC）by network pharmacology.Methods：The effective components and FC targets of Astragalus membranaceus and Atractylodes macrocephala drug pair were searched and screened by using network database.By using STRING database to construct protein interaction network（PPI）of Astragalus membranaceus-Atractylodes macrocephala drug pair for constipation treatment，the core targets were topologically analyzed.Finally，bioprocess and pathway enrichment analysis of drug-disease public targets was made through Metascape database.Results：A total of 27 FC-related active ingredients and 497 potential targets were screened out from the Astragalus-Atractylodes macrocephala drug pair.By topological analysis，16 core targets were obtained.A total of 20 enrichment results were obtained by enrichment analysis.Among them，GO（gene ontology，GO）biological process cells had the largest number of targets enriched in cellular response to hormone stimulus（cellular response to hormone stimulus）.Conclusion：Astragalus-Atractylodes macrocephala drug pair is multi-component，multi-target and multi-channel in the treatment of FC，and its mechanism may be mainly realized through the regulation of cell response to hormone stimulation.It also suggests that this pathway is an important direction for future research on the mechanism of Astragalus-Atractylodes Macrocephala drug in the treatment of FC.
Keywords Network pharmacology; Astragalus-Atractylodes Macrocephala; Drug pair; Functional Constipation; Mechanism research
中圖分类号：R242;R574文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.003
功能性便秘（Functional Constipation，FC）是便秘的常见类型，其临床表现主要为排便费力，排便次数减少，排便不尽感等，其发病因素与排除明确的药物性因素和肠道器质性因素等因素有关[1]。FC是一种临床常见病，多发病，在女性和中老年人中发病率更高[2]。黄芪-白术药对治疗功能性便秘效果确切，并有广泛运用，但其具体作用成分和作用靶点尚未见到相关报道。最近几年，网络药理学为研究中药药效的具体作用机制提供了思路，因其具有以“疾病、基因、药物、靶点”为基础的特色[3]。我们拟通过网络药理学的方法筛选黄芪-白术有效成分，确定疾病作用靶点，为进一步分析其治疗功能性便秘机制提供循证依据。
1 资料与方法 1.1 黄芪-白术有效成分挖掘 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库以“huangqi”“baizhu”为关键词进行检索;按口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18条件筛选中药成分。
1.2 黄芪-白术有效成分靶点预测 在TCMSP数据库中查询黄芪、白术有效成分对应的靶点蛋白，并导入Unitprot数据库查询蛋白的基因名称，同时进行基因名标准化处理。
1.3 FC疾病的靶点预测 分别在Drugbank数据库（www.drugbank.ca/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）中，以关键词“Functional constipation”进行检索，收集功能性便秘相关的靶点基因，并查阅文献进行补充遗漏靶点信息;然后导入Uniprot数据库进行基因名标准化处理，并进行整理归纳。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图的构建与分析 先将黄芪、白术有效成分作用靶点进行去重，再与FC靶点组建“成分-疾病”靶点数据库，取二者交集，组成“成分-疾病”映射文件，即寻找成分与疾病共有的靶点。利用交集出的共有靶点与化合物成分，通过STRING数据库建立“黄芪、白术-便秘靶点”的PPI网络。利用Cytoscape软件对靶点蛋白互作网络以连接度（Dregree=6.73）进行筛选，拓扑分析得到靶点核心网络图。
1.5 生物通路及富集分析 利用Metascape数据库针对“药物-疾病”公共靶点进行生物功能和通路的富集分析，根据富集结果对“黄芪-白术”治疗便秘的机制进行预测。
2 结果
2.1 “黄芪-白术”的有效成分收集和筛选 通过运用TCMSP数据库，以“黄芪”“白术”为关键词进行成分搜索，共得到药物有效成分144个，其中白术56个，黄芪88个;基于药代动力学参数（ADME），按照口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18条件，进行有效性筛选，同时查阅文献进行补充，共得到“黄芪-白术”有效成分27个，其中黄芪20个，白术7个。见表1。由结果得知“黄芪-白术”有效成分主要包含黄酮类、萜类、脂类等;其中具有良好的OB和DL值有：Isoflavanone（异黄烷酮）、Mairin（丁子香萜）、α-Amyrin（α-香树精）、Hederagenin（常春藤皂苷元）等等。由此可以推测黄芪-白术药对具有多成分的药理特点。
2.2 “黄芪-白术”有效成分靶点预测与成分-靶点关系网络图的构建 利用TCMSP数据库，将“黄芪-白术”27个有效成分在数据库内进行检索，获取其有效成分的对应靶点，共496个。并将其导入Unitprot数据库（http：//www.Unitprot.org/）进行基因名标准化处理，再通过Cytoscape3.7.2软件构建“黄芪白术-有效成分-靶点”网络图。见图1。该图由162个节点组成，红色菱形符号代表中药名，蓝色三角形符号代表有效成分，绿色“V”字形符号代表有效成分所对应的靶点，节点与节点之间的边表示成分与靶点之间的相互作用关系，平均自由度6.45，最大自由度88，最小自由度1。
2.3 疾病靶点信息的收集 在Drugbank、TTD、GeneCards数据库中以“Functional constipation”为关键词进行数据搜索。以“Relevance score>7”进行筛选，共寻找到靶点基因463个。其中Drugbank 51个、TTD 12个、GeneCards 400个。将以上数据库合并整理后并导入Uniprot数据库进行基因标准化处理，再以Uniprot ID為标准，利用EXCEL表格的“删除重复值”功能，对数据进行去重，最终筛选得到疾病靶点342个;通过Cytoscape3.7.2软件构建FC“疾病-靶点”网络图。见图2。
2.4 PPI网络的构建
利用EXCEL表格筛选功能，将463个FC疾病靶点和496个药物有效成分靶点进行合并，取二者交集，得到药物成分和疾病的共有靶点122个。把这122个靶点导入STRING数据库建立起“黄芪、白术-FC靶点”的PPI网络图，再将该结果以STV格式导出，导入Cytoscape3.7.2软件中对该网络进行拓扑分析，以大于平均Degree值6.73为筛选标准，得到16个核心节点。见表2。并构建核心靶点PPI网络图。见图3。结果提示该16个靶点在整个网络中占据重要地位，提示这些靶点可能是黄芪白术发挥药效治疗作用的关键所在。
2.5 生物通路及富集分析
通过Metascape数据库，对药物与疾病公共靶点进行生物功能和通路的富集分析，然后把122个公共靶点输入到该数据库中，筛选背景设定为“Human”进行富集分析，根据靶点富集在通路上的数目以降序原则对通路进行排序。见图4。
图4A、B中，颜色深浅表示不同富集程度，富集程度越高颜色越深。图4C中不同颜色节点表示不同通路。可以看出，黄芪-白术治疗FC的关键靶点主富集在细胞对激素刺激的反应生物过程上最多，其次是PID AR TF通道、细胞对有机环状化合物的反应生物过程、神经活性配体-受体相互作用KEGG通路等。见图4A。由富集结果可以推测，“黄芪-白术”治疗FC具有多通路的特点，其参与机制众多较为复杂，根据公共靶点的富集程度来看，GO生物过程中细胞对激素刺激的反应上靶点富集数目最多;预测治疗FC的机制可能主要通过细胞对激素刺激的反应的调控来实现，也提示该通路是未来研究黄芪-白术药对治疗FC的重要方向。
3 讨论
现代医学认为FC病因病机复杂，发病原因多见心态，性别，年龄，饮食，遗传，知识水平等因素，发病机制多表现为Cajal间质细胞减少，肠道内容物改变，排便动力学改变，肠神经系统改变等。FC不仅病因病机复杂，而且危害严重，治疗困难。长期的FC很容易导致痔疮、肛裂等肛肠疾病的发生，提高胃肠道肿瘤的发病率，加重高血压、心脏病等慢性疾病的临床症状，甚至诱发死亡[4]。现代医学在治疗FC时主要以口服泻药治疗为主，近期通便效果好，但远期效果欠佳，不仅无法治愈便秘，还可能导致结肠黑变病等不良反应。 古代医籍对功能性便秘的记载有“大便难”“不大便”“大便秘”等，直至清代才正式确定“便秘”之名，并沿用至今[5]。中医学认为便秘的发生与多脏腑密切相关，但其主要病位在大肠，可因脾虚失运、胃热炽盛、肺热下移等导致肠道传导失司所致。中医治疗便秘以辨证论治口服中药为主，临床起效虽慢，但毒性及不良反应少，且具有多成分、多靶点等优势。
王永炎[6]将便秘分为气虚型、血虚型、阴虚型、阳虚型、冷秘、热秘、气秘7类，是现今最常用的便秘分型。其中气虚型便秘主因肺脾气虚引起，肺气虚损，宣降失常，脾气虚弱，无以运化，从而导致大肠无力传导糟粕，形成便秘。黄芪归脾经、肺经、有补气升阳，益卫固表之功，白术归脾经、胃经，有补气健脾之功，二者均为补气之要药，同归脾经，切中气虚型便秘病机，二者常相须配伍使用治疗气虚型便秘[7]，如常见的黄芪白术通便汤[8]、补中益气汤[9]、自拟升提固本汤[10]等。有数据挖掘表明，黄芪-白术药对在功能性便秘的运用中高达120次[11]。
研究发现，黄芪的药理作用有协调肠道环境，促进氧化代谢，增强肠道肌肉紧张度等;生白术的药理作用有增加肠道肌肉紧张度和肠道动力等。此外，白术对肠道的作用还与白术的剂量和炮制方法有关[12]，低剂量的白术可以促进肠蠕动，而当剂量到达一定阈值以上，白术反而会抑制胃肠运动[13];生白术因挥发油含量高，可以促进肠蠕动，而炒白术因酯含量高，可以抑制肠蠕动[12]，所以在治療便秘时应选用小剂量生白术与黄芪配伍。肠道动力不只是FC发生的一个重要因素，黄芪、白术可通过增加肠道动力，改善肠道功能，从而达到治疗FC的目的[14-15]。当黄芪-白术药对治疗FC时，其发挥作用的主要靶点是GSK-3β。GSK-3β是一种多功能的氨基酸激酶，当这种酶在脑中高度表达时，与多种神经系统疾病如阿尔茨海默病和双相情感障碍的发生密切相关，而当这种酶在脑肠肽系统中高表达时，又可间接改变胃肠动力[16-17]。CALM3是黄芪-白术药对治疗FC的又一关键靶点，这个靶点其本质是一种蛋白质，因其能与钙离子结合，故又称之为钙调蛋白。有研究表明，钙调蛋白与肠道平滑肌收缩机制密切相关，当钙调蛋白发生变化时，不仅会影响平滑肌正常收缩，还会导致肠道Cajal间质细胞（Imerstitial Cells of Cajal，ICC）自噬过度，从而引起胃肠动力障碍，导致FC的发生[18]。NOS2和NOS3属于NOS的不同类型，其主要区别为NOS对钙是否具有依赖性，当NOS对钙具有依赖性时归于NOS3，当NOS对钙无依赖性时归于NOS2。NOS与NO关系密切，是NO合成中唯一的酶。NO作为一种抑制性神经递质，其在肠神经系统中表达时可以调控胃肠道动力，若NOS水平升高会通过影响NO的表达从而抑制胃肠道动力、影响胃肠道的运动导致FC的发生[19-20]。作为核受体超家族的一员，孕激素受体（Progesterone Receptor，PGR）与孕激素有密不可分的关系，PGR可通过影响孕激素从而导致FC的发生。研究表明，孕激素与1CC有一定关系，当人体孕激素增加时，发现肠道1CC数量减少，发生FC的概率升高[21]。
本研究结果显示，黄芪-白术参与治疗功能性便秘的主要活性物质是黄酮类、萜类、脂类等，其中具有良好OB和DL值的有异黄烷酮（Isoflavanone）、丁子香萜（Mairin）、α-香树精（α-Amyrin）、常春藤皂苷元（Hederagenin）等。国内研究表明，黄酮类成分具有抗癌，抗氧化、促进代谢、抑制焦虑等作用[22]，萜类成分具有抗氧化、抗炎、保护心肌、保护神经等作用[23]，由此推测黄芪-白术可能从缓解神经焦虑情绪，增强机体代谢，促进肠道蠕动等方面治疗FC。
黄芪-白术治疗FC的关键核心靶点GSK3B，CALM3，NOS2，PGR，NOS3等则主要富集在细胞对激素刺激的反应、PID AR TF通道、细胞对有机环状化合物的反应生物过程、神经活性配体-受体相互作用等通路上。神经活性配体-受体相互作用通路意义非凡，它集中了质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体[24]。GSK3B、CALM3、NOS2、PGR、NOS3等核心靶点可以归为激素、有机环状化合物和神经递质等物质，通过对细胞的刺激和反应，从而调节Ca2+，NO，孕激素等，影响ICC数量和脑肠肽系统，达到治疗FC的效果。
综上所述，黄芪-白术药对治疗FC具有多成分、多靶点、多通路的特点，其机制可能主要通过对细胞对激素刺激反应的调控来实现，也提示该通路是未来研究黄芪-白术药对治疗FC机制的重要方向。利用网络药理学平台对黄芪、白术成分靶点及FC疾病靶点进行预测，对临床探究黄芪-白术药对治疗FC机制的研究具有重要意义。
参考文献
[1]王冬冬，吴相柏.功能性便秘的诊治进展[J].中国全科医学，2019，22（24）：3016-3022.
[2]中华医学会消化病学分会胃肠动力学组，中华医学会消化病学分会功能性胃肠病协作组.中国慢性便秘专家共识意见（2019，广州）[J].中华消化杂志，2019，39（9）：577-598.
[3]Hopkins AL.Network pharmacology：the next paradigm in drug discovery[J].Nat Chem Biol，2008，4（11）：682-690.
[4]潘飞辰，沈洪.中医治疗功能性便秘研究进展[J].河南中医，2015，35（7）：1718-1720.
[5]沈金鳖.杂病源流犀烛[M].北京：中国中医药出版社，1991：10.
[6]王永炎.中医内科学[M].上海：上海科学技术出版社，1997：250-251.
[7]林余霖.中国药典中药材及混伪品彩色图谱[M].北京：中医古籍出版社，2017：149，461. [8]王旭峰，胥冬梅.黄芪白术通便汤治疗老年功能性便秘的临床观察[J].中国中医药科技，2018，25（5）：737-738.
[9]朱章帅，蒋开平.蒋开平教授运用补中益气汤临床经验[J].世界中西医结合杂志，2019，14（9）：1244-1246，1315.
[10]苏亮，贾小强，曹威巍，等.升阳固本法论治老年性便秘心得[J].江苏中医药，2019，51（6）：48-49.
[11]何萍萍，范小华，梁学敏，等.中药治疗老年功能性便秘用药规律数据挖掘研究[J].中国中医药信息杂志，2019，26（12）：103-107.
[12]吴翰桂，朱玲，马勇军.白术对小鼠胃肠道活动的影响的实验研究[J].江苏中医药，2005，26（11）：72-73.
[13]冯文林，伍海涛.白术治疗腸道疾病的作用机制探讨[J].辽宁中医杂志，2016，43（1）：125-127.
[14]周萍，周滢.黄芪与白术的配伍机制及临床应用浅析[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（17）：261-263.
[15]李超男，龚雨萍.慢传输型便秘用药规律的文献研究[J].江苏中医药，2018，50（1）：73-75.
[16]Jope RS，Roh MS.Glycogen synthase kinase-3（GSK3）in psychiatric diseases and therapeutic interventions[J].Curr Drug Targets，2006，7（11）：1421-1434.
[17]Mazanetz MP，Fischer PM.Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases[J].Nat Rev Drug Discov，2007，6（6）：464-479.
[18]纪云西，凌江红，庞黎明，等.Cajal间质细胞、细胞自噬与胃肠动力障碍[J].广西医科大学学报，2013，30（3）：485-487.
[19]Tomita R，Igarashi S，Fujisaki S，et al.The effects of neurotensin in the colon of patients with slow transit constipation[J].Hepatogastroenterology，2007，54（78）：1662-1666.
[20]贾蕊，邢海娇，张选平，等.不同刺灸法对功能性便秘大鼠血浆一氧化氮、一氧化氮合酶及结肠血管活性肠肽的影响[J].针刺研究，2017，42（1）：50-55.
[21]付志本，段全红，任斌，等.女性激素与结肠动力学的相关性[J].潍坊医学院学报，2009，31（2）：138-140.
[22]何庆，陈萍萍，李昊，等.黄酮类化合物对CYP1A1酶抑制活性的3D-定量构效关系研究[J].中草药，2021，52（5）：1343-1350.
[23]高佳琪，焦顺刚，马瑾煜，等.丁香属植物中萜类成分研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（10）：2343-2352.
[24]潘玲珍，闫智勇，左长英，等.长期使用地西泮对神经活性配体受体相互作用信号通路的影响[J].中国药科大学学报，2011，42（5）：443-446.
（2020-07-10收稿 责任编辑：杨觉雄）