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摘要：
潜血测定对恶性肿瘤的检验十分重要，而免疫胶体金技术是测潜血的重要方法，因其操作简便、快速、灵敏等优点应用广泛。本文就如何放大作用信号以提高此法的灵敏度及如何做到半定量、仪器定量检测的问题提出了几点建议。
关键词：胶体金；免疫层析法；潜血；灵敏度；定量
【中图分类号】
R749.053 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）06-0288-01
前言：
潜血测定是检验是否有恶性肿瘤及是否有炎症、结石的重要方法[1]。胶体金免疫层析法测潜血因其具有单份检测、简单快速、特异灵敏、和可肉眼观察结果等特点，成为当今最快速灵敏方便的免疫学检测技术之一[2]。但胶体金技术仍存在一定劣势，如存在带现象，灵敏度有待提高，未能定量等[3]。关于此法灵敏度改善及定量测量的问题仍有很大研究空间。下文为理论研究后提出的几个方案：
关于提高灵敏度
方案一：
先进工艺生产高质量胶体金颗粒，优化硝酸纤维素膜、样品垫等。同时各种膜，甚至包括样品垫要经过预期处理以减少非特异吸附[4]。
1.胶体金颗粒应大小、形状尽量一致，更均匀。同时找出最合适的颗粒半径。以此提高灵敏度，特异性和稳定性。
1.1 颗粒如果不均匀，在标记时表面将不能均匀包被蛋白质，在溶液中的分布也会不均匀，成品的颜色、灵敏度、特异性和稳定性就会受到影响。不均一的颗粒形状和大小会产生很不均匀的蛋白质包被，会导致金标存放时出现结块和聚合，在干燥过程中，颗粒形状的不规则导致其不能与蛋白质紧密结合，使得表面蛋白质很容易与胶体金分离，产生假阴性和深背景。另一个问题因为未完全包被的金颗粒直接暴露在垫上而不能释放，这就意味着金表面的蛋白质或永远吸附在基材上，或脱离金颗粒被冲走了，导致金标不能以正常速度并且完全地从金标垫上释放。应研究先进生产工艺使得其瞬间形成晶核，使晶核更均匀，稳定。
1.2 颗粒越大，颗粒的积累越容易看到。空间位阻将成为一个很大的问题，使它们难和特异蛋白结合。另外，颗粒越大，一定体积溶液中所含的数量越少，所以需要找到最合适的颗粒半径。
2. 选择合适的醋酸纤维薄膜孔径大小，并且做到孔径均一性，尽可能减少检测误差[5]。
方案二：
引进信号放大系统，如生物素-链亲和素系统。
亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，由4个亚单位组成，每个亲和素能结合4个分子的生物素，亲和素与生物素之间的亲和力级强，比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍，因此二者结合特异性高、稳定性好。生物素易与蛋白质以共价键结合，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，在起到了多级放大作用的同时，酶又在遇到相应底物时因催化作用而呈色，从而达到检测未知抗原分子的目的。
将链亲和素和抗人血红蛋白（Hb1）单克隆抗体结合，作为薄膜上检测区的捕捉物；将胶体金及其标记的抗人血红蛋白（Hb2）单克隆抗体与生物素（BNHS）结合。应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，使携带分析物的胶体金复合物极易与检测区上捕捉物结合，提高检测灵敏度。
关于使用仪器定量检测
方案一：
把设计成只能结合已知定量的分析物的反应剂做成检测线，过量的分析物就会和下一条检测线结合，产生一个温度计式的条带梯度。精确控制每条条带一致性，通过大量实验获得显色条代数与检测物浓度之间的关系。根据显色条带的数目以及最后一条条带颜色深浅即可达到半定量。
方案二：
光电比色法使用分光光度计测定所显颜色强度
根据Lambert-Beers法则，当一束平行的单色光通过含有吸光物质的溶液时，溶液的吸光度（A） 与溶液的浓度 （C） 和吸收层厚度 （b） 的乘积成正比
A=εCb
将标准血红蛋白溶液溶解于亚硝酸钠和叠氮化钠溶液中，氧合血红蛋白和去氧血红蛋白中的二价铁离子会被亚硝酸钠氧化成三价铁离子，成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白和叠氮化钠形成有颜色复合物。其最大波长为540nm。将所得复合物溶液稀释一定倍数，用分光光度计在其最大波长测定其吸光度，得到一条该复合物吸光度关于浓度的标准曲线[6]。
将含有样品的醋酸纤维薄膜按上述方法同样测吸光度。即可从标准曲线上查得血红蛋白浓度，即检测出了所显颜色强度。
小结
免疫胶体金技术出现以来发展十分迅速，应用也越来越广泛，该技术经过多年的使用，显示了众多的优势：操作简单易行，无需特殊设备，无毒无污染等[7]。如果能提高此法灵敏度并且做到定量测量则又实现了一大步跨越。本文提出的一些改善灵敏度方法及定量方法仅基于理论研究，真正应用还需进一步的试验。
参考文献
[1] 胶体金技术在生物安全检测中的应用.检验世界网[引用日期2012-12-9]
[2] 朱忠勇.实用医学检验学.北京：人民军医出版社，1992. 87
[3] 李妍，宁云山，李明.胶体金免疫层析技术及其在疟疾诊断中的应用[J].国外医学临床生物化学与检验学分册， 2004，25（5）：403
[4] 免疫胶体金测试原理.检验世界网[引用日期2012-010-11]
[5] 张惠娟. 对胶体金试纸法测定便隐血试验的评价与比较[J]. 现代中西医结合杂志， 2008 （23）.
[6] 王兴国， 狄建设， 王磊， 等. 快速全血定量测定血红蛋白在无偿献血中的应用[J]. 临床输血与检验， 2006， 8（2）： 139-139.
[7] 吴子安， 胡珺， 黄丽英， 等. 化学法与免疫胶体金法检测粪潜血的比较[J]. 实用医技杂志， 2006， 13（16）： 2801-2802.
[8] Lieberman DA.One—time screening for colorectal call—eer with combined fecal occult—blood testing[J].N Engl JMed，2001，345（8）：555
潜血测定对恶性肿瘤的检验十分重要，而免疫胶体金技术是测潜血的重要方法，因其操作简便、快速、灵敏等优点应用广泛。本文就如何放大作用信号以提高此法的灵敏度及如何做到半定量、仪器定量检测的问题提出了几点建议。
关键词：胶体金；免疫层析法；潜血；灵敏度；定量
【中图分类号】
R749.053 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）06-0288-01
前言：
潜血测定是检验是否有恶性肿瘤及是否有炎症、结石的重要方法[1]。胶体金免疫层析法测潜血因其具有单份检测、简单快速、特异灵敏、和可肉眼观察结果等特点，成为当今最快速灵敏方便的免疫学检测技术之一[2]。但胶体金技术仍存在一定劣势，如存在带现象，灵敏度有待提高，未能定量等[3]。关于此法灵敏度改善及定量测量的问题仍有很大研究空间。下文为理论研究后提出的几个方案：
关于提高灵敏度
方案一：
先进工艺生产高质量胶体金颗粒，优化硝酸纤维素膜、样品垫等。同时各种膜，甚至包括样品垫要经过预期处理以减少非特异吸附[4]。
1.胶体金颗粒应大小、形状尽量一致，更均匀。同时找出最合适的颗粒半径。以此提高灵敏度，特异性和稳定性。
1.1 颗粒如果不均匀，在标记时表面将不能均匀包被蛋白质，在溶液中的分布也会不均匀，成品的颜色、灵敏度、特异性和稳定性就会受到影响。不均一的颗粒形状和大小会产生很不均匀的蛋白质包被，会导致金标存放时出现结块和聚合，在干燥过程中，颗粒形状的不规则导致其不能与蛋白质紧密结合，使得表面蛋白质很容易与胶体金分离，产生假阴性和深背景。另一个问题因为未完全包被的金颗粒直接暴露在垫上而不能释放，这就意味着金表面的蛋白质或永远吸附在基材上，或脱离金颗粒被冲走了，导致金标不能以正常速度并且完全地从金标垫上释放。应研究先进生产工艺使得其瞬间形成晶核，使晶核更均匀，稳定。
1.2 颗粒越大，颗粒的积累越容易看到。空间位阻将成为一个很大的问题，使它们难和特异蛋白结合。另外，颗粒越大，一定体积溶液中所含的数量越少，所以需要找到最合适的颗粒半径。
2. 选择合适的醋酸纤维薄膜孔径大小，并且做到孔径均一性，尽可能减少检测误差[5]。
方案二：
引进信号放大系统，如生物素-链亲和素系统。
亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，由4个亚单位组成，每个亲和素能结合4个分子的生物素，亲和素与生物素之间的亲和力级强，比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍，因此二者结合特异性高、稳定性好。生物素易与蛋白质以共价键结合，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，在起到了多级放大作用的同时，酶又在遇到相应底物时因催化作用而呈色，从而达到检测未知抗原分子的目的。
将链亲和素和抗人血红蛋白（Hb1）单克隆抗体结合，作为薄膜上检测区的捕捉物；将胶体金及其标记的抗人血红蛋白（Hb2）单克隆抗体与生物素（BNHS）结合。应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，使携带分析物的胶体金复合物极易与检测区上捕捉物结合，提高检测灵敏度。
关于使用仪器定量检测
方案一：
把设计成只能结合已知定量的分析物的反应剂做成检测线，过量的分析物就会和下一条检测线结合，产生一个温度计式的条带梯度。精确控制每条条带一致性，通过大量实验获得显色条代数与检测物浓度之间的关系。根据显色条带的数目以及最后一条条带颜色深浅即可达到半定量。
方案二：
光电比色法使用分光光度计测定所显颜色强度
根据Lambert-Beers法则，当一束平行的单色光通过含有吸光物质的溶液时，溶液的吸光度（A） 与溶液的浓度 （C） 和吸收层厚度 （b） 的乘积成正比
A=εCb
将标准血红蛋白溶液溶解于亚硝酸钠和叠氮化钠溶液中，氧合血红蛋白和去氧血红蛋白中的二价铁离子会被亚硝酸钠氧化成三价铁离子，成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白和叠氮化钠形成有颜色复合物。其最大波长为540nm。将所得复合物溶液稀释一定倍数，用分光光度计在其最大波长测定其吸光度，得到一条该复合物吸光度关于浓度的标准曲线[6]。
将含有样品的醋酸纤维薄膜按上述方法同样测吸光度。即可从标准曲线上查得血红蛋白浓度，即检测出了所显颜色强度。
小结
免疫胶体金技术出现以来发展十分迅速，应用也越来越广泛，该技术经过多年的使用，显示了众多的优势：操作简单易行，无需特殊设备，无毒无污染等[7]。如果能提高此法灵敏度并且做到定量测量则又实现了一大步跨越。本文提出的一些改善灵敏度方法及定量方法仅基于理论研究，真正应用还需进一步的试验。
参考文献
[1] 胶体金技术在生物安全检测中的应用.检验世界网[引用日期2012-12-9]
[2] 朱忠勇.实用医学检验学.北京：人民军医出版社，1992. 87
[3] 李妍，宁云山，李明.胶体金免疫层析技术及其在疟疾诊断中的应用[J].国外医学临床生物化学与检验学分册， 2004，25（5）：403
[4] 免疫胶体金测试原理.检验世界网[引用日期2012-010-11]
[5] 张惠娟. 对胶体金试纸法测定便隐血试验的评价与比较[J]. 现代中西医结合杂志， 2008 （23）.
[6] 王兴国， 狄建设， 王磊， 等. 快速全血定量测定血红蛋白在无偿献血中的应用[J]. 临床输血与检验， 2006， 8（2）： 139-139.
[7] 吴子安， 胡珺， 黄丽英， 等. 化学法与免疫胶体金法检测粪潜血的比较[J]. 实用医技杂志， 2006， 13（16）： 2801-2802.
[8] Lieberman DA.One—time screening for colorectal call—eer with combined fecal occult—blood testing[J].N Engl JMed，2001，345（8）：555